驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： 設(shè)置四組平行標(biāo)記反應(yīng)，每組使用100 µg抗體，分別加入20 µg、50 µg、100 µg、200 µg活化HRP，嚴(yán)格遵循試劑盒說明書操作。
ELISA檢測(cè)： 抗原按100 ng/孔包被ELISA板，封閉后，將四組標(biāo)記產(chǎn)物分別進(jìn)行倍比梯度稀釋，并加入對(duì)應(yīng)孔位反應(yīng)。洗滌后，加入TMB底物顯色，終止后讀數(shù)。
結(jié)論： 數(shù)據(jù)明確顯示，100 µg抗體對(duì)應(yīng)100 µg HRP的標(biāo)記比例已足夠（即可獲得理想信號(hào)）。繼續(xù)增加HRP用量不僅無效（浪費(fèi)），反而可能因過量的HRP而增加非特異性背景。
蛋白摩爾質(zhì)量= 25,000 g/mol。
蛋白質(zhì)量 =1 mg =0.001 9。
0.001g
=4x 10-8mol.蛋白摩爾數(shù) = 質(zhì)量/摩爾質(zhì)量 =
25,000g/mol
步驟2: 計(jì)算可用的伯氨基總數(shù)
每個(gè)蛋白分子有2個(gè)伯氨基。
總伯氨基摩爾數(shù) = 蛋白摩爾數(shù) x每個(gè)蛋白的伯氨基數(shù)=4x10-8molx2=8x10-8mol
步驟3: 計(jì)算結(jié)合的HRP摩爾數(shù)
每個(gè)伯氨基結(jié)合一個(gè)HRP分子，因此HRP摩爾數(shù)=總伯氨基摩爾數(shù)=8x10-8mol.步驟4: 計(jì)算結(jié)合的HRP質(zhì)量
。HRP質(zhì)量=HRP摩爾數(shù)xHRP摩爾質(zhì)量=(8x10-8mol)x(44,000g/mol)
。計(jì)算:
8x10-8x44,000=8x10-8x4.4x104=35.2x10-4g=3.52x10-3巴轉(zhuǎn)換為毫克(1g=1000 mg)3.52 x10-3g=3.52mg.