His tag堪稱純化標(biāo)簽一哥，我想沒有人會站出來反對。做蛋白親和純化的人就沒有沒聽過His名號的。
我們稀里糊涂跟它打交道了很多年，有天突然就想一個問題：
這貨當(dāng)初是怎么來的？
是誰發(fā)明了它？
時代的呼喚?。?！
在上世紀(jì)70年代，蛋白質(zhì)的分離和純化技術(shù)相對有限，需要新的方法來提高分離效率和純度。
01
His tag用于蛋白純化的思想啟蒙
1975年, J. Porath等人的研究論文中，實(shí)驗(yàn)者將金屬螯合親和層析（Metal chelate affinity chromatography, 簡稱MCAC）技術(shù)應(yīng)用于蛋白分離【1】。研究者首先將金屬離子（如Cu2+、Ni2+等）固定到IDA-衍生的凝膠上，形成金屬螯合親和層析介質(zhì)。利用這種介質(zhì)，研究者進(jìn)行了蛋白質(zhì)的吸附實(shí)驗(yàn)，探究不同蛋白質(zhì)與金屬離子的親和性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，某些蛋白質(zhì)可以特異性地結(jié)合到固定化的金屬離子上，而其他蛋白質(zhì)則沒有這種結(jié)合能力。通過改變?nèi)芤旱膒H值或使用競爭性配體，可以有效地從親和層析介質(zhì)上洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。
這項技術(shù)利用了蛋白質(zhì)上的某些氨基酸殘基（如組氨酸、半胱氨酸、賴氨酸等）與金屬離子（如鎳、銅、鋅等）的親和作用，通過這些金屬離子固定在帶有亞氨基二乙酸（iminodiacetic acid, IDA）或其他配體的樹脂上，實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的親和層析。
這項研究成果的發(fā)表標(biāo)志著親和層析技術(shù)在蛋白質(zhì)分離領(lǐng)域的應(yīng)用邁出了重要的一步。它不僅為后來的研究人員提供了一種新的蛋白純化實(shí)驗(yàn)方法，而且為理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能提供了新的視角。
02
His tag的雛形
1988年，Smith等人提出了在蛋白質(zhì)N-末端添加特定的金屬螯合肽（Chelating Peptide, CP），以增強(qiáng)其與固定金屬離子的結(jié)合能力，從而提高純化效率。這種方法被稱為CP-IMAC，它通過在目標(biāo)蛋白質(zhì)上引入一個CP序列，使得蛋白質(zhì)能夠通過IMAC被特異性地純化【2】。
實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計了螯合肽His-Trp與促黃體激素釋放激素（LHRH）類似物2-10 LHRH的N-末端融合表達(dá),結(jié)果融合蛋白可以與Ni2+形成配位復(fù)合物并具有高親和性。此外，實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計了His-Trp-胰島素原作為重組CP-蛋白質(zhì)模型，利用該模型研究了其在大腸桿菌中表達(dá)，研究其與固定化Ni2+的結(jié)合和洗脫情況。
03
His tag的發(fā)展
1989年，瑞典斯德哥爾摩皇家理工學(xué)院生物化學(xué)與生物技術(shù)系Ljungquist C等人也利用基因融合方法，將目標(biāo)蛋白的基因與編碼親和肽段Ala-His-Gly-His-Arg-Pro的基因片段融合，為了使表達(dá)的融合蛋白可以與固定化金屬離子（Zn2+）結(jié)合而利用親和色譜法（IMAC）進(jìn)行純化，研究者合成了編碼親和肽段的連接體，以上述編碼親和肽段為基本單位，分別做兩次，四次串聯(lián)聚合，這樣制備出分別含有2個、4個和8個His氨基酸的親和肽段，然后將這肽段與編碼雙結(jié)構(gòu)域蛋白A分子ZZ的基因的3'端和編碼β-半乳糖苷酶的基因的5'端融合。研究發(fā)現(xiàn)，不含有或兩個His的親和肽段的融合蛋白與固定化Zn2+的結(jié)合能力較弱，而含有4個或8個His的親和肽段的融合蛋白則顯示出較強(qiáng)的結(jié)合作用。通過pH梯度改變，發(fā)現(xiàn)ZZ融合蛋白可以根據(jù)親和肽His的數(shù)量多少在不同的pH值下從樹脂上洗脫，His數(shù)越多，結(jié)合力越強(qiáng)，洗脫的pH值越低【3】。
His-Gly-His 這樣的結(jié)構(gòu)，可對Co2+,Ni2+ 和 Cu2+有高親和力，但是我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)人員緊隨其后連接一個Arg，其目的是為了增加正電荷，該標(biāo)簽不但可以用于親和層析，還能用于離子交換純化。隨著親和肽重復(fù)數(shù)的增加，其pI（Isoelectric point,蛋白質(zhì)等電點(diǎn)）值不斷升高，這與Arg有關(guān)，精氨酸的設(shè)計就是為了調(diào)節(jié)pI；研究人員緊隨其后還加了一個Pro,原來胰蛋白酶樣蛋白酶在哺乳動物、人和細(xì)菌中都廣泛存在，偏好切割堿性氨基酸后面的肽鍵，如果在堿性氨基酸后面緊接著一個Pro，則可以大大減少該酶對肽鍵的降解。
另外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，如果親和肽標(biāo)簽放在N-端，β-galactosidase局有完全酶活性，但如果放在c-端其活性將大大降低。這就提示我們，標(biāo)簽位置很重要。
這是1989年的一篇文獻(xiàn)，足以看出本文作者扎實(shí)的生化專業(yè)功底。讀完這篇文獻(xiàn)，我們再利用His標(biāo)簽進(jìn)行蛋白純化的時候，不應(yīng)該只會簡單利用現(xiàn)有質(zhì)粒載體上的6XHis了，更不應(yīng)該遇到6XHis標(biāo)簽純化不下來的蛋白，直接粗暴加長到8XHis，甚至12xHis；不但如此，我們還要牢記標(biāo)簽的位置很重要，雖然說放在目標(biāo)蛋白的N-端或者C-端都可以，甚至是蛋白結(jié)構(gòu)凸起的序列內(nèi)，標(biāo)簽位置對后續(xù)的純化影響很大，對蛋白活性影響更大。
至于這篇文章中為什么用Zn2+,而不是用Ni2+,我還沒有找到答案，可能是Zn2+結(jié)合力弱于Ni2+，洗脫條件會更溫和一些，利于保護(hù)蛋白質(zhì)活性。
這篇1989年的文章信息量之大，含金量之高，時至今日，仍具有很大的參考價值。
04
6XHis tag的確立
說到這里，我們還有一個問題，為啥那些商業(yè)化載體上大部分是6XHis標(biāo)簽，這個“6”是怎么來的？
1988年，Hochuli等人以小鼠二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase, DHFR)為演示蛋白分別在其N-端和C-端融合2-6個His，然后將這系列蛋白在大腸桿菌里表達(dá)，通過Ni2+-NTA親和純化研究。研究結(jié)果表明，只有當(dāng)His個數(shù)達(dá)到6的時候，重組蛋白在6M GuHCl的溶液里,才能達(dá)到90%以上的結(jié)合效果。也就是說6XHis tag可以在大多數(shù)相對極端環(huán)境（比如鹽酸胍）下保證重組蛋白與Ni2+-NTA親和填料的最佳結(jié)合效果【4】。當(dāng)然，在PBS溶液中，2-4個His標(biāo)簽都會有很好的結(jié)合率；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明，相同數(shù)量的His標(biāo)簽，在N-端和C-端，其結(jié)合效果還是很有差異的，上文我們也提到了，His標(biāo)簽放在不同的位置，不但會影響其活性還會影響其與Ni2+-NTA的結(jié)合效率。
05
His tag的位置問題
His tag通常被設(shè)計融合在目標(biāo)蛋白的N-端或C-端，目標(biāo)蛋白與His tag之間還設(shè)計一段短的柔性多肽連接，這個短肽間可包括一個蛋白酶的切割位點(diǎn)（比如，TEV酶，腸激酶EK，等）。很少將標(biāo)簽設(shè)計在蛋白序列的內(nèi)部，偶爾也有設(shè)計在蛋白突出的環(huán)凸中。His標(biāo)簽的位置需要基于蛋白的特性考慮，有時可能需要設(shè)計多個不同標(biāo)簽位置的構(gòu)建體進(jìn)行測試，從中優(yōu)選。 盡管實(shí)驗(yàn)人員普遍認(rèn)為His tag比較小，不會影響蛋白的特性，但是文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和我們的實(shí)驗(yàn)案例證據(jù)都顯示，His-tag的添加對很多蛋白都有負(fù)面的影響，比如改變蛋白的聚集狀態(tài)，改變等電點(diǎn)，改變抗原的免疫原性和反應(yīng)原性，影響蛋白質(zhì)的酶活性，影響溶解度等等。
06
用于His tag融合蛋白純化的固相組成
所謂固相組成就是我們常說的純化填料，包括固相基質(zhì)、螯合劑和金屬離子。
市場上最常見的固相基質(zhì)主要有交聯(lián)瓊脂糖（sepharose）、交聯(lián)葡聚糖（sephadex）、大孔硅膠及一些有機(jī)聚合物等，近些年，磁珠也很流行。
至于螯合劑，亞氨基二乙酸 (iminodiacetic acid，IDA) 和氮三乙酸 (nitrilotriacetic acid，NTA) 的衍生物最常用，除此之外，還有N,N,N-三（羧甲基）乙烯二胺（TED）、四乙烯戊胺（TEPA）、羧甲基α,β-二胺丁二酸（CM-DASA）和乙二胺N,N-二乙酸（EDDA）等。
常用的金屬離子有：二價陽離子 Cu2+、Ni2+、Fe2+、Zn2+、Co2+等過渡金屬離子。金屬離子與螯合劑作用時，一般形成五元環(huán)或六元環(huán)，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，且環(huán)數(shù)目越多結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。
那么多金屬離子，為啥Ni2+受偏寵？
金屬陽離子的選擇通常是結(jié)合能力和純度之間的折衷。Ni2+比較中庸，因?yàn)樗谶@些因素之間提供了最好的平衡，而Co2+對His tag結(jié)合能力稍低，對內(nèi)源性蛋白質(zhì)的親和力也較低，常常用于高純度蛋白的提取純化。
07
His tag融合蛋白洗脫方法
利用His tag純化蛋白，從固相載體洗脫His tag融合蛋白，最常用的有三種方法，常常將這三種方法組合使用。為了避免蛋白質(zhì)變性和功能失活，盡可能選用溫和的方法。
1.類似物競爭洗脫
為了使His-tag 融合蛋白從載體上釋放，可以使用一種與 His-tag類似結(jié)構(gòu)的化合物，該化合物也與固相載體上的金屬離子形成配位復(fù)合物，將His-tag融合蛋白從固相載體上競爭下來，咪唑是組氨酸的側(cè)鏈，也就是我們在做His tag融合蛋白純化最為熟悉的洗脫試劑，通常以150 - 500 mM 的濃度用于洗脫，也可以使用組氨酸或組胺。
2.pH值降低
當(dāng) pH 值降低時，His殘基被質(zhì)子化，不再能與金屬離子配位，從而使蛋白質(zhì)被洗脫。當(dāng)使用Ni2+作為金屬離子時，它在 pH 值 4 左右洗脫，而Co2+在 pH 值 6左右洗脫。隨著His個數(shù)增多，其洗脫的pH也越低。
3.金屬離子螯合去除
強(qiáng)螯合劑（如 EDTA）可以直接螯合”搶走”通過螯合劑固定在固相載體上的金屬離子，因此蛋白質(zhì)會從固相載體上脫離。目前，有些商業(yè)化公司已經(jīng)開發(fā)出可以耐受EDTA的填料。
以上三種洗脫方法，第一種最溫和，是目前最常用的標(biāo)準(zhǔn)洗脫方法，當(dāng)然，洗脫劑不僅限于我們耳熟能詳?shù)倪溥?，還可以用組氨酸或者組胺；第二種最生猛，低pH溶液強(qiáng)酸溶液環(huán)境會對蛋白造成不可逆的損傷；第三種屬于殺雞取卵，強(qiáng)行將金屬離子從固相載體上剝脫下來，這個填料就廢了，不能再次使用，如果想要再次重復(fù)使用這個填料，需要重新加金屬離子，也就是所謂的重生，再次重生的填料在效果上肯定不如原裝出廠的純化效果好。
08
His tag用于重組蛋白純化
His tag非常廣泛地應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)純化，可以說是蛋白純化領(lǐng)域最亮的崽。
目前，很多商業(yè)公司研發(fā)出His tag融合重組蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)的系列產(chǎn)品，從重組蛋白表達(dá)載體構(gòu)建到純化填料，以及該系列產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，都有保姆級的使用教程和非常完善的指導(dǎo)體系。
但是，這些流程只對初學(xué)者掃盲有用，真正的有經(jīng)驗(yàn)的蛋白純化人員不應(yīng)僅僅拘泥于此。一分鐘學(xué)會的如此簡單His tag重組蛋白純化技術(shù)，遇到的問題大抵是讓你一年欲哭無淚，愛而不得：明明看到蛋白表達(dá)，卻是純不下來，或者純下來的雜蛋白比目標(biāo)蛋白還多，喧賓奪主。
這些商業(yè)化的表達(dá)載體上的蛋白表達(dá)單元框內(nèi)一般會設(shè)計連續(xù)的6個His(6xHis)在N-端或者C-端，或者兩端都有；當(dāng)我們將目標(biāo)蛋白基因通過多克隆位點(diǎn)（Multiple Cloning Site, MCS）插入達(dá)到表達(dá)載體的時候，可以構(gòu)建出N-端、C-端或者兩端都帶6xHis標(biāo)簽的融合蛋白。
基因合成技術(shù)如此發(fā)達(dá)的今天，誰還過度依賴于載體上那幾個His標(biāo)簽的有無和位置，目標(biāo)基因的插入誰還拘泥于多克隆位點(diǎn)的那幾個限制酶切位點(diǎn)憋屈，誰還局限于那老套的6XHis？
在此基礎(chǔ)上，研究人員設(shè)計出各種His tag的衍生玩法。
HQ tag
HQ tag標(biāo)簽的序列是HQHQHQ，是在6XHis tag的基礎(chǔ)上間隔著將氨基酸His改編為Gln, Becky Godat,等人在2008年的《 Affinity Chromatography_ Methods and Protocols》這本書的一個章節(jié)里描述了這個標(biāo)簽，書中沒有明確指出它比6XHis tag優(yōu)勢之處，但如果非要找出其優(yōu)勢點(diǎn)：分子量更小，在更低的咪唑濃度(50mM)濃度下可以洗脫HQ tag融合目標(biāo)蛋白，低濃度的咪唑?qū)Φ鞍赘押茫ǜ邼舛鹊倪溥蚋菀资沟鞍踪|(zhì)聚集），也更利于目標(biāo)蛋白的下游實(shí)驗(yàn)，特別是酶活實(shí)驗(yàn)【5】。
攜帶HQ tag的商業(yè)化載體Flexi® Vectors出自promega這個公司，百度搜索關(guān)鍵詞“HQ tag”，搜索結(jié)果第一條就是promega公司的Flexi® Vectors信息。
6XHN tag
6X HN標(biāo)簽（HN tag）是His與Asn形成小單元（HN）連續(xù)重復(fù)6次,即（HN）6，它與6XHis標(biāo)簽相比，其與金屬離子結(jié)合力更強(qiáng)一些，關(guān)于這個標(biāo)簽的文獻(xiàn)相對較少。
Clontech(Takarabio)公司研發(fā)出pET6xHN Expression Vector產(chǎn)品，并申請了相關(guān)專利，專利號US7176298。
HAT tag
HAT tag是一種新型陽離子親和標(biāo)簽，源自雞乳酸脫氫酶，氨基酸序列為KDHLIHNVHKEEHAHAHNK，它包含六個His，與其他氨基酸殘基不均勻交錯分布。HAT tag與 His tag相比,它是一種無電荷分布偏差的可溶性蛋白質(zhì)，因此，HAT tag融合蛋白具有更好的溶解性。不但如此，HAT tag中His的不均勻交錯排列使其具有更高的可及性，能更有效與固定化的金屬離子結(jié)合。HAT tag融合蛋白可以在中性pH下與固定化的金屬離子結(jié)合吸附，此中性溶液環(huán)境下，細(xì)胞裂解物中存在的堿性蛋白酶活性較低，利于大多數(shù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定和活性保持。
HAT被Clontech(Takarabio)注冊了商標(biāo)，其公司也開發(fā)出HAT蛋白表達(dá)及純化系統(tǒng)系列產(chǎn)品，又是保姆級教程【6】。
【小結(jié)】
His tag用于純化的前景展望
重組蛋白純化就像黑夜，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)或者發(fā)明的標(biāo)簽充其量也只是夜空里的星星而已，還有更多的未知需要我們?nèi)ッ?。使用商業(yè)化的系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，我們可能只知道6X His標(biāo)簽，甚至8X His標(biāo)簽，對應(yīng)的純化填料也就只知道Ni2+親和樹脂，至于標(biāo)簽的融合位置，我們往往也只考慮融合在目標(biāo)蛋白的N-端或者C-端，或者兩端都融合。其實(shí)，His tag不僅僅局限于6X His tag，8X His tag，HQ tag，HN tag，HAT tag，你還可以根據(jù)目標(biāo)自身的特征自由發(fā)揮，為其量身定制。自由設(shè)計His tag你不但需要考慮其融合位置，還要全方位考慮其電荷性，親水性，可及性，酶切位點(diǎn)，水解穩(wěn)定性等等因素，所有的小心翼翼，都是為了給目標(biāo)蛋白的純化過程一個更易獲取的方案、給蛋白一個更舒適的環(huán)境?；蚝铣杉夹g(shù)如此發(fā)達(dá)的今天，你所設(shè)計的序列將不受限于目前這些商業(yè)化載體的所謂多克隆位點(diǎn)和現(xiàn)有標(biāo)簽的框框，一言不合就全基因合成。
至于商業(yè)化的配套的純化產(chǎn)品，最常用的就是Ni2+填料，次常用的還有上文提及的Co2+和Cu2+。保姆級教程中，洗脫液中最常用的還是咪唑，其實(shí)，洗脫劑不僅限于咪唑，組胺衍生物都應(yīng)該可以，比如組氨酸和組胺。關(guān)于純化填料樹脂，我不太了解，在此不敢多言。
His tag在蛋白純化領(lǐng)域的應(yīng)用，其序列和結(jié)構(gòu)形式上的設(shè)計遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于上述所提及的這些。七八十年發(fā)明這個標(biāo)簽的幾篇最原始的文獻(xiàn)，已經(jīng)告訴了我們His tag最底層的邏輯，只是隨著技術(shù)的發(fā)展，勤快的商業(yè)化公司制造出一些比較好用的懶人工具，讓大部分人只知道6 X His和Ni2+樹脂填料。
未來利用His tag進(jìn)行蛋白純化，肯定需要考慮比上述所提及的更多因素，而考慮這些因素僅僅靠人工數(shù)著氨基酸去琢磨肯定不行，必然需要借助于計算機(jī)設(shè)計出最佳的His標(biāo)簽。
在應(yīng)用領(lǐng)域上，His tag不僅限于蛋白純化，還可用于熒光標(biāo)記示蹤，Pull down實(shí)驗(yàn)和免疫檢測等。選擇合適的螯合劑與熒光素偶聯(lián)，只需要在目標(biāo)蛋白上設(shè)計合適的His tag，就可以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的示蹤定位。Pull down實(shí)驗(yàn)其實(shí)跟His tag蛋白純化原理差不多。至于免疫檢測，除了目標(biāo)蛋白融合上合適的His tag外，還需要特異性的抗體配合，目前，針對His tag，HN tag，HAT tag，市面上都有物美價廉的商業(yè)化產(chǎn)品。
一個男人成功的背后，一定站著深明大義的女人。
His tag 的輝煌，同樣離不開二價陽離子們的默默付出。His tag 與 Ni2+ 的關(guān)系，就如同天作之合，雖然偶爾也會與 Co2+、Cu2+、Zn2+ 等其他陽離子搞個曖昧，但這些都無法與 Ni2+之間的深厚情誼相提并論。像這樣的神仙眷侶還有很多，比如：蛋白酶與蛋白酶抑制劑，凝集素與糖蛋白，受體與配體，酶與底物，當(dāng)然不能少了最耀眼的生物素與親和素。
標(biāo)簽故事諸多，后續(xù)笑談中