編者按
近日，基孔肯雅熱疫情在全球多地?cái)U(kuò)散，已有119個(gè)國(guó)家報(bào)告病例，約550萬(wàn)人面臨感染風(fēng)險(xiǎn)。基孔肯雅熱由基孔肯雅病毒(CHIKV)引起，作為一種主要經(jīng)伊蚊叮咬傳播的病毒性傳染疾病，可引起嚴(yán)重的關(guān)節(jié)疼痛、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等。一直以來(lái)，人類對(duì)基孔肯雅病毒的研究都從未止步。
本期，我們特別回顧一篇由法國(guó)巴斯德研究所研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表在病原體生物學(xué)頂刊《PLoS Pathogens》上的一項(xiàng)研究成果，該研究首次建立了斑馬魚(yú)模型，利用其胚胎通體透明等特性實(shí)現(xiàn)了基孔肯雅病毒（CHIKV）感染過(guò)程的全身實(shí)時(shí)可視化，并明確了中性粒細(xì)胞在抗病毒應(yīng)答中的核心地位，揭示了CHIKV的傳播機(jī)制和宿主免疫應(yīng)答，為理解CHIKV致病機(jī)制及開(kāi)發(fā)靶向療法提供了全新視角。
斑馬魚(yú)作為唯一能實(shí)現(xiàn)全身感染動(dòng)態(tài)可視化的脊椎動(dòng)物模型（斑馬魚(yú)模型丨環(huán)特抑菌/抗病毒功效評(píng)價(jià)模型一覽），在感染性疾病研究與新藥研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，如何有效終結(jié)基孔肯雅病毒持久性感染，正從斑馬魚(yú)透明的軀體中透出曙光。
01、斑馬魚(yú)：破譯感染的理想模型
基孔肯雅病毒(CHIKV)，是一種可能引發(fā)嚴(yán)重疾病的重新出現(xiàn)的蟲(chóng)媒病毒，對(duì)全球公共衛(wèi)生安全造成了重大威脅，但CHIKV在體內(nèi)的傳播、細(xì)胞嗜性及宿主先天免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程尚不清晰。如何在活體中實(shí)時(shí)觀察病毒感染的動(dòng)態(tài)過(guò)程？傳統(tǒng)的小鼠等哺乳動(dòng)物模型盡管能部分模擬人類疾病，但無(wú)法進(jìn)行活體全身水平的感染動(dòng)態(tài)、宿主抗病毒/炎癥反應(yīng)的可視化觀察。而斑馬魚(yú)的特性，使其成為解決這一難題的完美載體。
斑馬魚(yú)看似與人類迥異，但擁有約87%的人類基因同源性，且胚胎透明，非常適合體內(nèi)成像。其具有類似哺乳動(dòng)物的先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，更重要的是，出生后一個(gè)月內(nèi)的斑馬魚(yú)僅依賴先天免疫系統(tǒng)(髓系細(xì)胞:中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)，這正是研究病毒早期入侵機(jī)制的理想窗口。
其擁有I型干擾素(IFN1-4)，其中IFNФ1和IFNФ3在幼魚(yú)中起主要作用。當(dāng)研究人員向3天大的斑馬魚(yú)靜脈注射表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的基孔肯雅病毒（CHIKV-GFP），短短14小時(shí)內(nèi)，病毒在肝臟、肌肉、鰓部、腦部等多個(gè)器官同時(shí)點(diǎn)亮感染細(xì)胞，形成一波感染高潮。與哺乳動(dòng)物類似，CHIKV感染會(huì)觸發(fā)強(qiáng)烈的Type-l干擾素(IFN)反應(yīng)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，嗜中性粒細(xì)胞在控制CHIKV方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。
綜上所述，本研究結(jié)果表明，斑馬魚(yú)是一種新穎的、有價(jià)值的動(dòng)物模型，可用于動(dòng)態(tài)可視化人類病毒的復(fù)制、致病過(guò)程以及宿主的反應(yīng)。（斑馬魚(yú)模型丨環(huán)特抑菌/抗病毒功效評(píng)價(jià)模型一覽）
02、主要研究成果
1. 構(gòu)建斑馬魚(yú)基孔肯雅病毒模型，首次實(shí)現(xiàn)全身實(shí)時(shí)感染可視化觀測(cè)
本研究通過(guò)靜脈注射CHIKV-115或CHIKV-GFP(表達(dá)GFP的CHIKV)成功構(gòu)建了3日齡(dpf)的斑馬魚(yú)基孔肯雅病毒感染模型，首次在斑馬魚(yú)中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分辨率的全身病毒感染動(dòng)態(tài)成像。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CHIKV病毒在斑馬魚(yú)中有效復(fù)制（病毒滴度>10? TCID50/g組織），感染性病毒顆粒在感染后24-48小時(shí)達(dá)到峰值，其病理特征與哺乳動(dòng)物相似。qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，病毒E1基因和GFP轉(zhuǎn)錄本的動(dòng)力學(xué)與病毒滴度一致。
圖1
2. 斑馬魚(yú)CHIKV感染動(dòng)態(tài)圖譜揭示病毒擴(kuò)散與組織特異性
研究人員利用GFP標(biāo)記發(fā)現(xiàn)CHIKV-GFP感染了多種器官。感染初期病毒廣泛分布于肝臟、肌肉、血管等器官，后期向腦部集中（圖1D-E），且在頜骨、鰭、肝臟、血管、肌肉等多數(shù)器官中，感染細(xì)胞數(shù)量于1-2 dpi達(dá)到峰值，隨后迅速下降。
通過(guò)追蹤單個(gè)感染細(xì)胞從出現(xiàn)到死亡的全過(guò)程發(fā)現(xiàn)，感染細(xì)胞在注射后14小時(shí)（中位時(shí)間）集中出現(xiàn)，肝臟細(xì)胞平均存活27小時(shí)，腦細(xì)胞存活>72小時(shí)，死亡時(shí)間因器官而異。通過(guò)繪制感染動(dòng)態(tài)圖譜可見(jiàn)，感染細(xì)胞呈"單波次"出現(xiàn)（88%在24小時(shí)內(nèi)），死亡呈器官依賴性。
腦部感染細(xì)胞存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，表明大腦可能是病毒持久性儲(chǔ)存庫(kù)（圖2F），這與人類嬰兒CHIKV腦炎病例相關(guān)。與大多數(shù)器官不同，腦實(shí)質(zhì)中的感染在2 dpi出現(xiàn)，并持續(xù)至少至5 dpi，甚至在7 dpi仍可見(jiàn)強(qiáng)感染。固定樣本的IHC染色也證實(shí)了這一廣泛的感染模式。
圖2
圖3
3. I型干擾素（IFN）的關(guān)鍵作用
隨后，研究人員基于斑馬魚(yú)模型發(fā)現(xiàn)，CHIKV感染會(huì)觸發(fā)強(qiáng)烈的IFN-φ1/φ3反應(yīng)（圖4A-C）。CHIKV感染誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)I型IFN基因 inb1、ifnb3和IFN刺激基因viperin的表達(dá)水平明顯高于以往報(bào)道的魚(yú)類病毒。
敲除IFN受體（CRFB1/2）或信號(hào)分子MAVS，導(dǎo)致病毒載量增加100倍、死亡率>90%（圖4D-F），表明IFN通路是生存必需。 敲低MAVS會(huì)減少inb1 和 viperin 的表達(dá)，而敲低IFN受體則不影響 ifnb1 但阻斷 viperin 表達(dá)?？傊?，I型IFN信號(hào)通路對(duì)控制CHIKV復(fù)制和病理至關(guān)重要。
圖4
4. 免疫機(jī)制新發(fā)現(xiàn)：中性粒細(xì)胞是主要IFN生產(chǎn)者
研究人員通過(guò)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)（ifnφ1:mCherry）結(jié)合FACS分選驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞是CHIKV感染后產(chǎn)生IFN的主要白細(xì)胞類型。將中性粒細(xì)胞進(jìn)行雙重轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，80%的IFN-φ1+白細(xì)胞為中性粒細(xì)胞，其形態(tài)、分布、運(yùn)動(dòng)速度及顆粒特征等均與中性粒細(xì)胞相符。
感染后，mCherry+中性粒細(xì)胞數(shù)量在48 hpi顯著增加，并維持高水平至至少96 hpi。敲低IFN受體(CRFB1+2 MO處理)，阻止了中性粒細(xì)胞數(shù)量的增加。特異性敲低中性粒細(xì)胞csf3r MO或nos2a MO會(huì)顯著增加死亡率和病毒載量。這表明，CHIKV感染引起的中性粒細(xì)胞數(shù)量增加是依賴于宿主IFN反應(yīng)的。
進(jìn)一步的細(xì)胞消融實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞在控制CHIKV感染中起著至關(guān)重要的作用；肝細(xì)胞是第二IFN來(lái)源，但抗病毒作用較弱，而巨噬細(xì)胞消融對(duì)存活影響較小，這挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)認(rèn)知，并證實(shí)了中性粒細(xì)胞的關(guān)鍵作用?？傊?，"中性粒細(xì)胞-IFN軸"是抗CHIKV核心防線，為抗病毒策略提供了新靶點(diǎn)。
圖5
?圖6
目前，環(huán)特生物依托于國(guó)際領(lǐng)先的“斑馬魚(yú)、類器官、哺乳動(dòng)物、人體”多維生物技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，構(gòu)建了抑菌、抗病毒等200多種功效與安全性評(píng)價(jià)模型，為廣泛科研場(chǎng)景下的各類需求，提供“活體顯微鏡”級(jí)的、流程化、體系化的病毒感染機(jī)制解析、藥物篩選研發(fā)、功效驗(yàn)證等技術(shù)服務(wù)解決方案。（詳情請(qǐng)點(diǎn)擊：斑馬魚(yú)模型丨環(huán)特抑菌/抗病毒功效評(píng)價(jià)模型一覽）
03、編者點(diǎn)評(píng)
本研究首次動(dòng)態(tài)可視化實(shí)現(xiàn)了在斑馬魚(yú)中以單細(xì)胞分辨率實(shí)時(shí)觀察病毒感染的發(fā)生和發(fā)展，并將斑馬魚(yú)確立為研究CHIKV發(fā)病機(jī)制的新模型，其病毒傳播過(guò)程與哺乳動(dòng)物相似，為深入理解病毒與宿主相互作用、開(kāi)發(fā)新療法提供了強(qiáng)大的工具。此外，研究還揭示了中性粒細(xì)胞不僅是干擾素的主要生產(chǎn)者，更是控制CHIKV感染的關(guān)鍵防線，這一發(fā)現(xiàn)徹底顛覆了中性粒細(xì)胞僅是“炎癥士兵”的傳統(tǒng)認(rèn)知。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開(kāi)拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚(yú)生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚(yú)、基因編輯、類器官、哺乳動(dòng)物、人體”等多維生物技術(shù)服務(wù)體系，開(kāi)展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚(yú)模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺(tái)，歡迎有需要的讀者垂詢！
參考文獻(xiàn)：Nuno Palha,Florence., Jean-Pierre. et al. Real-Time Whole-Body Visualization of Chikungunya Virus Infection and Host Interferon Response in Zebrafish. PLoS Pathogens9(9): e1003619 (2013) .doi.org/10.1371/journal.ppat.1003619