CD127 VS Foxp3
雖然Foxp3是目前公認(rèn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最特異的指標(biāo)，但因其位于細(xì)胞內(nèi)，使得Foxp3的染色必須要固定細(xì)胞并破核膜，因此這種方法并不適用于分離活的Tregs，且該方法比較傳統(tǒng)，操作相對(duì)復(fù)雜，稍有不慎就會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
而CD127屬于細(xì)胞表面Marker，無(wú)需固定破膜。因此，當(dāng)前主流方向是通過(guò)CD127來(lái)檢測(cè)人Tregs。
CD127的發(fā)現(xiàn)
CD127是2006年被發(fā)現(xiàn)的一種檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的新指標(biāo)。由于不需要將細(xì)胞固定破膜處理，檢測(cè)起來(lái)要比Foxp3方便。
研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+純化的細(xì)胞中，CD127與Foxp3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)CD4+CD127low純化出的CD4+CD25+ T細(xì)胞，與Foxp3純化的CD4+CD25+ T細(xì)胞數(shù)量相似，并且這部分細(xì)胞展現(xiàn)了CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的典型特征。CD4+CD25+CD127-/low是較CD4+CD25+Foxp3+更優(yōu)的特異性檢測(cè)
配色方案
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細(xì)胞亞群 |
種屬 |
指標(biāo) |
熒光標(biāo)記 |
克隆號(hào) |
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Treg |
Human |
CD45 |
EV450 |
HI30 |
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CD3 |
ER780 |
OKT3 |
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CD4 |
FITC |
RPA-T4 |
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CD8a |
PerCP/Cyanine5.5 |
OKT-8 |
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CD25 |
PE |
BC96 |
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CD127 |
AF647 |
A019D5 |
人Treg鑒定所需流式抗體
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產(chǎn)品名稱 |
熒光素 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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CD45 |
EV450 |
E-AB-F1137Q |
20T |
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CD3 |
ER780 |
E-AB-F1001S |
20T |
|
CD4 |
FITC |
E-AB-F1109C |
20T |
|
CD8a |
PerCP/Cyanine5.5 |
E-AB-F1110J |
20T |
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CD25 |
PE |
E-AB-F1194D |
20T |
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CD127 |
AF647 |
E-AB-F1152M |
20T |
人Treg鑒定所需輔助試劑
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作用 |
貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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細(xì)胞染色 緩沖液 |
E-CK-A107 |
Cell Staining Buffer |
100mL |
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紅細(xì)胞 裂解液 |
E-CK-A105 |
10×ACK Lysis Buffer |
100mL |
樣本管設(shè)置
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目的 |
樣本 |
設(shè)置 |
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調(diào)電壓 |
1 |
Blank（空白管） |
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調(diào)補(bǔ)償 |
2 |
CD45-EV450 |
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3 |
CD3-ER780 |
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4 |
CD4-FITC |
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5 |
CD8a-PerCP/Cyanine5.5 |
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6 |
CD25-PE |
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7 |
CD127-AF647 |
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Full Panel |
8 |
CD45-EV450、CD3-ER780、CD4-FITC、CD8a-PerCP/Cyanine5.5、CD25-PE、CD127-AF647 |
實(shí)驗(yàn)步驟
01
在離心管內(nèi)加入100μL新鮮血，與2mL 1×ACK紅細(xì)胞裂解液混勻，4℃裂解10min；
02
300g離心5min（裂解完立即離心，防止時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損傷細(xì)胞），棄掉上清，用移液槍輕輕吸走殘液，可以得到白色的細(xì)胞沉淀；
03
加入100μL細(xì)胞染色緩沖液，重懸細(xì)胞，與流式抗體混勻，4℃孵育30min；
04
加入2mL細(xì)胞染色緩沖液，300g離心5min，棄掉上清，再加入200μL細(xì)胞染色緩沖液，重懸細(xì)胞；
05
上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
人外周血Treg細(xì)胞表型分析
解析：
? 熒光素間有溢漏，故需要設(shè)置單陽(yáng)管，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償；
? 本實(shí)驗(yàn)取正常人外周血驗(yàn)證