多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR)也稱復(fù)合PCR，由Chambehian'于1988年首次提出。其基本原理與常規(guī)PCR相同，區(qū)別在于多重PCR反應(yīng)體系加入一對以上引物，各對引物分別結(jié)合在模板相對應(yīng)部位，最終擴(kuò)增出一條以上目的DNA片段（圖1）。
圖1. 多重PCR原理
多重PCR可以通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件提高擴(kuò)增的片段數(shù)量。理論上只要PCR擴(kuò)增的條件合適，引物對的數(shù)量可以不限。另外，多重PCR在引物和反應(yīng)條件的設(shè)計(jì)方面表現(xiàn)出很大的靈活性，既有單個PCR的特異性和敏感性，又較之快捷和經(jīng)濟(jì)，自提出以來已被廣泛應(yīng)用于包括核酸診斷在內(nèi)的諸多領(lǐng)域（圖2）。
圖2.多重PCR的應(yīng)用
需要指出的是多重PCR實(shí)驗(yàn)并不是簡單地將多對特異性引物混合成一個反應(yīng)體系。多重PCR之所以難，在于多個靶點(diǎn)之間擴(kuò)增條件不兼容，每個靶點(diǎn)都需要旁邊其他的引物配合。舉個例子，就像綁腿賽跑（圖3）。
圖3. 綁腿賽跑
每個靶點(diǎn)的成功擴(kuò)增都需要被捆綁在一起的兩個人（一對引物）配合默契。而多重PCR就需要多對選手同時(shí)起跑又同時(shí)到達(dá)，并且所有參賽的每對選手都有最好的發(fā)揮。
因此，多重PCR實(shí)際操作過程中的擴(kuò)增效果和實(shí)際擴(kuò)增的片段數(shù)目往往不盡如人意。而為了達(dá)到更好的擴(kuò)增效果，一般我們可以通過以下幾個方面進(jìn)行優(yōu)化：
1. 引物
多重PCR實(shí)驗(yàn)中要求加入的多對引物既不能互相結(jié)合，也不能與模板DNA上目標(biāo)片段以外的區(qū)域結(jié)合。另外傳統(tǒng)的多重PCR實(shí)驗(yàn)中，為了使結(jié)果便于凝膠檢測，還需設(shè)計(jì)不同擴(kuò)增子片段大小不一。更麻煩的是，多重PCR中的不同擴(kuò)增片段還會互相競爭資源，其結(jié)果是高豐度模板能夠被很容易的檢測到，而低豐度的模板徹底淪為背景。因而引物設(shè)計(jì)除了遵循一般的規(guī)則之外，還需要注意以下幾點(diǎn)：
a. 引物特異性：
各引物與其它擴(kuò)增片段不能存在較大的互補(bǔ)性，擴(kuò)增片段之間也不能有較大同源性；
b. 引物長度：
一般18-24堿基，各引物之間不能互補(bǔ)，尤其避免3’端互補(bǔ)。較長的引物更易形成二聚體；
c. 退火溫度：
退火溫度選擇標(biāo)準(zhǔn)：提高每一對引物的退火溫度，然后在mPCR的時(shí)候采取最低退火溫度；
d. 引物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)：
通過一些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，避免非特異性擴(kuò)增或者引物二聚體。比如Omega引物（如圖3），該引物包括三部分，5’端的序列，Omega環(huán)，3’端序列。其中兩端的序列是和目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的，而環(huán)不是。對于Omega引物，當(dāng)5’端和3’端序列完全配對才可以進(jìn)行目標(biāo)區(qū)段擴(kuò)增，否則其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定（因?yàn)镺mega環(huán)存在），導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。
常用引物設(shè)計(jì)網(wǎng)址:
http://www.premierbiosoft.com/primerplex/index.html
http://people.ds.cam.ac.uk/ssb22/pooler/(only for cancer researchers)
2. 反應(yīng)體系
多重PCR的反應(yīng)體系也是影響擴(kuò)增效果的重要因素之一，體系中的各組分需滿足每對引物對應(yīng)的靶點(diǎn)的擴(kuò)增量的要求。反應(yīng)體系包括引物、模板、緩沖液、DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等，其作用與優(yōu)化方法如下表1所示。
表1. 反應(yīng)體系的優(yōu)化
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反應(yīng)體系 |
影響 |
優(yōu)化 |
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引物濃度 |
多重PCR體系中，就越多,片段越短引物用量和擴(kuò)增的目的片段長度有著正比內(nèi)在關(guān)系,即擴(kuò)增片段越長,所需引物相對就越多。同時(shí)引物間易相互影響導(dǎo)致擴(kuò)增效果不佳。 |
一般每種引物濃度E0 2μM左右，如果擴(kuò)增效果不佳可增加弱引物得量減少強(qiáng)引物的量，不同基因引物相對濃度有較大差異（0.05-0.4μM）。 理論上，引物與靶序列的摩爾比為103：1。 |
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模板濃度 |
模板DNA濃度過高導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，并且DNA有高級結(jié)構(gòu)，濃度過高影響與引物的退火。 |
哺乳動物基因組DNA 100ng/ml；酵母基因組DNA 1g/ml；細(xì)菌基因組DNA0.1ng/ml；質(zhì)粒DNA 1~5ng/ml。 |
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dNTP和Mg2+濃度 |
dNTP能夠結(jié)合鎂離子，而DNA聚合酶發(fā)揮活性需要游離的鎂離子。所以二者之間濃度需要平衡。 |
一般情況下200 μM 的dNTP要得到較好的擴(kuò)增結(jié)果需要Mg2+濃度為1.5~2 mM。 |
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PCR緩沖液 |
高鹽濃度會使長片段的擴(kuò)增產(chǎn)物難于變性解鏈。因而長片段產(chǎn)物在低鹽濃度下擴(kuò)增效果較好，而短片段產(chǎn)物在高鹽濃度下擴(kuò)增效果較好。 |
提高PCR緩沖液濃度，或者提高K+濃度至70-100mM。 |
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DNA聚合酶 |
聚合酶量過低造成擴(kuò)增產(chǎn)量的降低，過高導(dǎo)致基因擴(kuò)增不平衡以及以背景的輕微增高。 |
DNA聚合酶的最適濃度為每25 μL反應(yīng)體積中2U，實(shí)際根據(jù)擴(kuò)增效果進(jìn)行輕微調(diào)整。 |
注：本文中DNA聚合酶以Taq DNA聚合酶為例。具體實(shí)驗(yàn)中，還可以在反應(yīng)體系中適當(dāng)增加濃度為5%的DMSO或者5% 的甘油等輔助劑，有利于提高擴(kuò)增效率以及特異性。
3. 反應(yīng)條件
多重PCR反應(yīng)中會存在以下兩種問題：1）目的產(chǎn)物長度不盡相同，而較小片段總是優(yōu)先得到擴(kuò)增；2）各對引物的最佳PCR條件也不盡相同，比如較長片段需要更長的延伸時(shí)間。因此為了保證最終擴(kuò)增產(chǎn)物的量盡可能的一致，在優(yōu)化反應(yīng)條件的時(shí)候，盡可能選擇有利于較大片段擴(kuò)增的條件，見表2。
表2. 反應(yīng)條件的優(yōu)化
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反應(yīng)條件 |
影響 |
優(yōu)化 |
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復(fù)性溫度 |
復(fù)性溫度影響產(chǎn)物的特異性，提升復(fù)性溫度會使產(chǎn)物更加特異，但過高會導(dǎo)致目的基因無法擴(kuò)增。 |
先計(jì)算單個引物的熔解溫度(Tm)，在此基礎(chǔ)上推算復(fù)性溫度T0(T0＝Tm-5)，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用所有引物最低的復(fù)性溫度。 |
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延伸溫度 |
延伸溫度高會減少某些基因的擴(kuò)增,即使延長退火時(shí)間和延伸時(shí)間也可能無法消除這種影響。 |
一般65-72℃，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。 |
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延伸時(shí)間 |
多重PCR中,由于同時(shí)擴(kuò)增多個基因,酶和dNTP的缺乏就成為限制因素，就需要更多的時(shí)間來完成所有產(chǎn)物的合成。多重PCR中增加延伸時(shí)間,可以增加較長PCR產(chǎn)物的量。 |
根據(jù)目的片段的大小以及DNA聚合酶的擴(kuò)增效率確定延伸時(shí)間。 |
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循環(huán)數(shù) |
循環(huán)數(shù)過低影響目標(biāo)基因的產(chǎn)量，過高對于產(chǎn)量無明顯影響 |
PCR產(chǎn)物量增加最明顯的是在25個循環(huán)附近，通常28-30個循環(huán)即可 |
3. 常見問題解決辦法
多重PCR擴(kuò)增的時(shí)候主要的問題：二聚體、非特異性擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較弱。
表3. 常見問題解決辦法
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常見問題 |
建議 |
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引物二聚體 |
a.重新設(shè)計(jì)引物，最根本的解決辦法 |
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b.重新優(yōu)化反應(yīng)條件如提高退火溫度 |
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c.重新優(yōu)化反應(yīng)體系如適當(dāng)提高模板濃度，降低引物濃度 |
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d.提高退火溫度 |
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產(chǎn)物條帶弱 |
所有條帶 |
a.增加延伸時(shí)間 |
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b.降低延伸溫度至62-68℃ |
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c.逐步降低退火溫度 |
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d.適當(dāng)提高DNA聚合酶濃度 |
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短片段產(chǎn)物 |
a.提升緩沖液濃度 |
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b.降低退火或者延伸溫度 |
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c.增加弱條帶的相對引物量 |
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長片段產(chǎn)物 |
a.增加延伸時(shí)間 |
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b.提高退火/延伸溫度 |
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c.增加弱條帶的相對引物量 |
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d.保持Mg2+濃度不變，降低緩沖液濃度 |
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非特異性擴(kuò)增 |
a.若非特異性片段為長片段，則增加反應(yīng)緩沖液濃度；若是短片段，降低緩沖液濃度 |
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b.逐漸提高退火溫度 |
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c.降低模板和DNA聚合酶用量 |
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d.保持dNTP濃度不變，增加Mg2+濃度 |
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多重PCR要求在同一反應(yīng)體系內(nèi)對多個位點(diǎn)進(jìn)行特異性擴(kuò)增。因而引物間的配對與競爭性擴(kuò)增均會影響擴(kuò)增效果。如果能選擇合適的反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件則有望提高多重PCR的擴(kuò)增效果。所以在進(jìn)行多重PCR的時(shí)候，不應(yīng)墨守陳規(guī)，要根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)情況對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行不斷優(yōu)化，達(dá)到最佳擴(kuò)增效果。