編者按
了解基因組的每個基因在胚胎發(fā)育過程中對個體表型的貢獻(xiàn)，是發(fā)育遺傳學(xué)的基本目標(biāo)。單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)的成熟，使全胚胎細(xì)胞圖譜的建立成為可能。然而，這些數(shù)據(jù)大多是從野生型胚胎中收集的，并未對發(fā)育過程中存在的潛在變異進(jìn)行評估。
生命發(fā)育基因能否像代碼一樣被"逆向編譯"？美國華盛頓大學(xué)發(fā)表在Nature的一項研究，在斑馬魚胚胎中首次實(shí)現(xiàn)全胚胎尺度、單細(xì)胞精度的反向遺傳操作，并構(gòu)建了"受干擾胚胎的斑馬魚單細(xì)胞圖譜"(ZSCAPE)。
通過利用斑馬魚Crispant技術(shù)（斑馬魚Crispant技術(shù)：基因功能研究新范式）、高通量單細(xì)胞核RNA測序及Sci-Plex多重標(biāo)記等技術(shù)，鑒定出33種主要組織中的99種細(xì)胞類型、156種細(xì)胞亞型，實(shí)現(xiàn)了對大量個體胚胎單細(xì)胞水平的全面分析，為大規(guī)模、高通量的胚胎發(fā)育及基因功能研究鋪平了道路，將加快對胚胎發(fā)育的研究，并促進(jìn)對特定基因突變?nèi)绾斡绊懻麄€胚胎中的細(xì)胞而致病機(jī)制的理解。
01、研究概述
本研究中構(gòu)建了“受干擾胚胎的斑馬魚單細(xì)胞圖譜”，收集了1812個單獨(dú)解析發(fā)育中的斑馬魚類胚胎的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括19個時間點(diǎn)、23個遺傳干擾和3.2 百萬個細(xì)胞。這一研究中的高度復(fù)制（每個條件下有八個或更多胚胎）使研究人員能夠評估整個生物體內(nèi)細(xì)胞類型豐度的變化，并檢測細(xì)胞類型組成相對于野生型胚胎的擾動依賴性偏差。這一方法對罕見的細(xì)胞類型很敏感，可以解析腦神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育軌跡和遺傳依賴性，腦神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元是一個占胚胎不到1%的細(xì)胞群體。
此外，對單個突變體的時間序列分析發(fā)現(xiàn)了一組與脊索鞘細(xì)胞具有驚人相似轉(zhuǎn)錄組的短距離獨(dú)立細(xì)胞，這導(dǎo)致了關(guān)于頭骨早期起源的新假設(shè)。研究人員預(yù)計，從大量個體胚胎中標(biāo)準(zhǔn)化收集高分辨率、生物體規(guī)模的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，將有助于繪制斑馬魚細(xì)胞類型的遺傳依賴性，同時也解決發(fā)育遺傳學(xué)中的長期挑戰(zhàn)，包括個體表型多樣性背后的細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄可塑性。
02、主要研究成果
1. ScEdiT單細(xì)胞編輯追蹤技術(shù)的革命性突破
本研究通過Sci-Plex多重標(biāo)記技術(shù)、CRISPR-cas9基因編輯技術(shù)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（sci-RNA-seq3）技術(shù)等整合，首創(chuàng)了ScEdiT單細(xì)胞編輯追蹤技術(shù)平臺，為大規(guī)模、高通量的胚胎發(fā)育研究鋪平了道路。
Sci-Plex多重標(biāo)記技術(shù)，可以將不同樣本中的細(xì)胞或細(xì)胞核“散列”標(biāo)記組合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞溯源，對多個個體同時進(jìn)行分析；利用斑馬魚Crispant技術(shù)（斑馬魚Crispant技術(shù)：基因功能研究新范式）可以在胚胎早期階段（F0）產(chǎn)生高效突變體，實(shí)現(xiàn)程序化、高效的基因編輯，徹底繞開了傳統(tǒng)方法需要幾代才能獲得穩(wěn)定突變體的漫長周期；單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以一次對數(shù)百萬個細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)胚胎的規(guī)模檢測，并動態(tài)追蹤其變化，大大提高了實(shí)驗效率。
2. 建立ZSCAPE斑馬魚單細(xì)胞圖譜
本研究構(gòu)建了ZSCAPE“受干擾胚胎的斑馬魚單細(xì)胞圖譜”，收集了1812個單獨(dú)解析發(fā)育中的斑馬魚類胚胎的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括19個時間點(diǎn)、23個遺傳干擾和320 萬個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。在每個時間點(diǎn)，研究人員收集了48—140個胚胎，在四個單細(xì)胞組合索引RNA測序（sci-RNA-seq3）實(shí)驗中，進(jìn)行約17000-231000個高質(zhì)量細(xì)胞的單核轉(zhuǎn)錄組。盡管在不同平臺上收集而來，但這些數(shù)據(jù)與早期斑馬魚scRNA-seq數(shù)據(jù)相一致。
總體而言，研究人員將細(xì)胞分為33種主要組織、99種廣泛的細(xì)胞類型和156種細(xì)胞亞型。
圖片圖1 斑馬魚單細(xì)胞圖
3. 基于斑馬魚crispant技術(shù)進(jìn)行胚胎高分辨率的表型分析
隨后，研究人員基于斑馬魚Crispant技術(shù)、Sci-Plex標(biāo)記分析了由CRISPR–Cas9突變產(chǎn)生的斑馬魚F0敲除物在發(fā)育過程中的細(xì)胞組成變化和單細(xì)胞遺傳擾動。通過靶向量化23個基因擾動導(dǎo)致的102種細(xì)胞豐度變化，如noto敲除減少脊索細(xì)胞、增加底板細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)中腦神經(jīng)前體細(xì)胞中，cdx4敲除導(dǎo)致hoxb3a/hoxc3a/hoxc6b這3個Hox基因顯著下調(diào)；最后一組的gRNA能夠在F0期敲除后產(chǎn)生預(yù)期表型，且不影響細(xì)胞存活。
接著，研究人員鑒定出了多種顯著差異豐度的細(xì)胞類型(DACTs)。例如，調(diào)控早期體節(jié)譜系的轉(zhuǎn)錄因子Tbx16,Msgn1,Tbx16的突變體crispants表現(xiàn)出一致且顯著的細(xì)胞類型豐度變化，這些轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞（NMPS）向中胚層祖細(xì)胞（MPCs）和脊髓后祖細(xì)胞（pSPCs）的分化。數(shù)據(jù)顯示，在這些基因突變體中，MPC和pSPC譜系均逐漸增多，揭示了這些因子對兩種譜系的協(xié)同控制作用。
圖片圖2 斑馬魚胚胎的高分辨率表型
目前，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術(shù)服務(wù)體系，并具備10余年斑馬魚基因編輯技術(shù)經(jīng)驗，基于斑馬魚crispant技術(shù)具有的功能研究周期短、表型直觀、活體分子機(jī)制快速驗證和產(chǎn)卵量大、陽性表型個體多等優(yōu)勢，為廣泛科研場景下的各類需求，提供流程化、體系化、模塊化的斑馬魚Crispant技術(shù)服務(wù)等。（詳情請點(diǎn)擊：斑馬魚Crispant技術(shù)：基因功能研究新范式）
03、編者點(diǎn)評
本研究構(gòu)建了“斑馬魚胚胎擾動單細(xì)胞圖譜”（ZSCAPE），并首次實(shí)現(xiàn)了基因擾動與全胚胎細(xì)胞表型的動態(tài)關(guān)聯(lián)，通過標(biāo)準(zhǔn)化胚胎尺度單細(xì)胞分析，將反向遺傳學(xué)推入“全胚胎+單細(xì)胞+時序”三維時代，為構(gòu)建遺傳依賴全景圖譜、解析復(fù)雜表型的非編碼調(diào)控機(jī)制，從而推動精準(zhǔn)醫(yī)療的胚胎尺度建模開辟了新路徑。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、基因編輯、類器官、哺乳動物、人體”等多維生物技術(shù)服務(wù)體系，開展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！