反轉(zhuǎn)錄（ReverseTranscription,RT），是將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA的關(guān)鍵步驟，廣泛應(yīng)用于qPCR、基因克隆、測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)。然而，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常會(huì)遇到各種問(wèn)題。今天，我們就來(lái)詳細(xì)盤點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)問(wèn)題，分析可能的原因，探討解決方法，讓你的實(shí)驗(yàn)順利推進(jìn)！
01 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無(wú)或產(chǎn)量低
1.RNA質(zhì)量不合格
RNA降解（提取過(guò)程未嚴(yán)格防止RNase污染）；RNA純度低（A260/A280或A260/A230比值異常）；樣本儲(chǔ)存不當(dāng)（反復(fù)凍融或長(zhǎng)期存放于20℃）。
解決方案：
使用新鮮提取的RNA，避免反復(fù)凍融，長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議80℃；可通過(guò)跑膠檢查RNA完整性，真核生物28S與18S條帶亮度約為2:1；確保A260/A280在1.8-2.0，過(guò)低可能含蛋白/酚污染，A260/A230最好大于2.0，小于1.6說(shuō)明有鹽或有機(jī)物嚴(yán)重殘留）。
2.反轉(zhuǎn)錄酶活性不足
酶儲(chǔ)存不當(dāng)，反復(fù)凍融或長(zhǎng)期置于4℃；反應(yīng)體系未優(yōu)化，受酶量不足或Buffer成分影響；反應(yīng)溫度不合適。
解決方案：
分裝保存反轉(zhuǎn)錄酶，避免反復(fù)凍融，通常20℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存）；按照說(shuō)明書推薦比例使用酶，必要時(shí)提高酶量（尤其對(duì)于較難進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的GC含量較高的RNA）；根據(jù)樣本特點(diǎn)選擇合適的反轉(zhuǎn)錄酶。
3.引物選擇不當(dāng)
隨機(jī)引物對(duì)長(zhǎng)RNA覆蓋不全；Oligo(dT)引物不適合無(wú)Poly(A)尾的RNA（如原核RNA）。
解決方案：
對(duì)真核mRNA：Oligo(dT)+隨機(jī)引物組合提高覆蓋率；對(duì)原核RNA或病毒RNA：優(yōu)先使用基因特異性引物或隨機(jī)引物。
02 反轉(zhuǎn)錄有產(chǎn)物但無(wú)法成功PCR
1.cDNA合成不完整
反轉(zhuǎn)錄溫度或時(shí)間不足，尤其對(duì)于長(zhǎng)片段或復(fù)雜RNA；RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)未充分變性；引物與模板互補(bǔ)性不好。
解決方案：
提高反轉(zhuǎn)錄溫度（通常50-55℃）；預(yù)變性RNA（65℃5min后迅速冰浴，破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)）；確保引物與模板的互補(bǔ)性良好，從引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件考慮，避免引物二聚體的形成影響結(jié)合。
2.反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含抑制劑
反轉(zhuǎn)錄體系中殘留乙醇、鹽或SDS等污染物；cDNA未純化直接用于PCR（某些酶Buffer抑制Taq酶）。
解決方案：
使用柱式純化或乙醇沉淀去除抑制劑；若直接使用cDNA，建議稀釋后進(jìn)行PCR，以降低抑制劑對(duì)PCR的影響。
03 特殊樣本的反轉(zhuǎn)錄優(yōu)化
1.低豐度RNA
增加RNA起始量；使用高效率、高靈敏度的反轉(zhuǎn)錄酶，以反轉(zhuǎn)錄低豐度RNA。
2.高GC或復(fù)雜結(jié)構(gòu)RNA
在反轉(zhuǎn)錄之前，在65℃加熱RNA 5min，使二級(jí)結(jié)構(gòu)變性，然后在冰上迅速冷卻；通過(guò)在較高的溫度下（例如50℃）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以最小化發(fā)夾序列形成的可能；使用能夠承受高反應(yīng)溫度的熱穩(wěn)定反轉(zhuǎn)錄酶。
3.微量樣本（如單細(xì)胞RNA）
RNA保護(hù)與防降解，在裂解液中加入RNase抑制劑；優(yōu)先選擇專為微量樣本設(shè)計(jì)的酶；使用高靈敏度反轉(zhuǎn)錄酶。
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