nature子刊 (IF=15.7)｜西安交大郭燕教授團隊解析pt-DVT，9種代謝物panel賦能早診，同步挖掘治療關鍵靶點
英文標題：Integrated landscape of plasma metabolism and proteome of patients with post-traumatic deep vein thrombosis
中文標題：創傷后深靜脈血栓患者血漿代謝和蛋白質組學的系統分析
發表期刊：nature communications
影響因子：15.7
客戶單位：西安交通大學
百趣提供服務：新一代代謝組學NGM 2 Pro
研究背景
深靜脈血栓形成(Deep Vein Thrombosis, DVT)是一種主要的健康問題，可導致各種并發癥，如血栓后綜合征、復發性DVT和危及生命的肺栓塞(Pulmonary Embolism, PE)。先前的研究已經確定了DVT的多種危險因素，如高齡、不活動、手術和住院。特別是，創傷個體繼發于損傷模式和不活動的DVT風險增加。創傷后DVT(post-traumatic DVT, pt-DVT)長期以來被認為是成人人群中最相關的臨床問題之一，它也是創傷后發病率和死亡率的主要原因。目前，pt-DVT的診斷依賴于d-二聚體的實驗室測量和超聲的特定成像特征(Ultrasound, US)，但d-二聚體在手術后或創傷性事件后的DVT風險患者中的應用尚不清楚。此外，手術可能造成繼發性創傷，創傷患者血栓形成的預防和早期診斷在住院和圍手術期護理中具有挑戰性。因此，識別pt-DVT的生物標志物對于早期診斷和提供適當的DVT治療是必要和重要的。
為了研究pt-DVT的潛在代謝機制，并在創傷性骨折患者中識別DVT患者，研究者使用非靶標代謝組學和蛋白組學研究pt-DVT患者和對照組之間的血漿代謝和蛋白的變化，并篩選與pt-DVT相關的生物標志物。
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研究結果
2.1 研究隊列的臨床特征
研究設計和分析工作流程如圖1所示。根據嚴格的納入/排除標準，共有680名患者被納入發現(N=580)隊列和驗證(N=100)隊列。在發現隊列中，從2018年10月至2020年12月招募了252名診斷為偶發性pt-DVT的患者作為病例，328名未診斷為DVT的患者作為對照。隨后，從2021年3月至2021年7月，選擇了50名pt-DVT患者和50名對照組，采用相同的招募標準作為單獨的驗證隊列。pt-DVT組和對照組的基本特征大致平衡。
圖1.實驗設計與分析流程
2.2 pt-DVT患者的血漿代謝組特征
經過MS/MS鑒定和數據過濾，在所有批次中可重復檢測到的326種代謝物被認為是穩定的，并保留用于后續分析。通過正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA)對兩組間的代謝物進行分析，鑒定出96種對差異有顯著貢獻的代謝物（圖2d）。通過單變量和多變量分析，共有28種代謝物是顯著變化的，并繪制了28種代謝物的聚類熱圖（圖2e）。
去偏稀疏偏相關(Debiased Sparse Partial Correlation, DSPC)網絡（圖3a）顯示了偏相關系數顯著的關系。該網絡的拓撲結構表明，不同分類間和同一分類中代謝物之間存在密集的相互作用，其中脂質和氨基酸代謝之間的相互作用最為密集。此外，功能未知的代謝物主要占據了N2,N2-二甲基鳥苷和丙酮酸這兩個代謝物附近的位置，這表明它們可能參與了脂質、氨基酸、核苷酸和碳水化合物的代謝。這些發現共同表明，一個高度協調的代謝物調控網絡是血栓形成的基礎。
圖2.pt-DVT患者和對照組的代謝譜
圖3.與pt-DVT相關的多種代謝途徑失調
2.3 與pt-DVT相關的多種代謝途徑失調
通路分析中，研究者發現了17條涉及氨基酸代謝、碳水化合物代謝和脂質代謝的顯著失調通路（圖3b），表明pt-DVT組存在大規模代謝失調。17條顯著改變的通路差異豐度(Differential Abundance, DA)評分（圖3c）顯示6條參與氨基酸代謝的通路活性升高；與碳水化合物代謝相關的所有5條通路的活性均顯著上調，包括已被充分研究的檸檬酸循環（TCA循環）和糖酵解/糖異生；而與脂質代謝相關的3條通路的活性均下調。此外，研究者還發現了一些在pt-DVT中研究較少的氨基酸代謝途徑，如半胱氨酸和蛋氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等。
2.4 pt-DVT患者CP簇改變
研究者確定了14個顯著改變的臨床指標(Clinical Parameters, CPs)，其中5個在pt-DVT患者中增加，其他的減少(4a)。Pearson相關分析顯示CPs顯著增加或減少，并傾向于聚集在一起（圖4b）。有趣的是，功能相似的臨床特征被分組在一個簇中，如CP最高的簇，包括纖維蛋白原(Fibrinogen, Fbg)、血小板紅細胞壓積(Platelet Hematocrit, PCT)和血小板計數(Platelet Count, PLT)，而降低最多的簇包括紅細胞計數(Red Blood Cell Count, RBC)、紅細胞壓積百分比(Hematocrit Percentage, HCT)和血紅蛋白濃度(Hemoglobin Concentration, HGB)。在此基礎上，研究者揭示了pt-DVT的兩個典型臨床特征，一個是PLT-PCT-Fbg增加（稱為PLT簇），另一個是RBC-HCT-HGB減少（稱為RBC簇）。
研究者進一步評估了這6種CPs在PLT簇和RBC簇中診斷pt-DVT的效果，結果顯示，PLT和PCT對pt-DVT具有極好的特異性，可能是有臨床應用前景的診斷標志物。
圖4.pt-DVT及相關代謝失調的臨床差異指標
5.代謝組變化與pt-DVT相關血液特征之間的關系
通過計算代謝物和CPs的Pearson相關性系數，發現18種代謝物與PLT簇相關，17種代謝物與RBC簇相關，表明同一簇內的CPs具有相似的代謝模式。接下來，研究者使用線性回歸模型，發現16種代謝物與PLT簇顯著相關（圖4c），15種代謝物與RBC簇相關（圖4d）。研究者進一步使用與兩者相關的代謝物進行了基于代謝途徑的富集分析，如圖4e所示，可能調控PLT簇改變的8條代謝途徑主要涉及脂質代謝，尤其是脂肪酸的氧化。在這些途徑中確定了4個關鍵代謝物，包括丙酰肉堿、左旋肉堿、5,6-DHET和5-羥色胺。
血漿中丙基肉堿、左旋肉堿和血清素水平升高與PLT、PCT和Fbg水平呈正相關。此外，有26條代謝途徑與RBC簇相關（圖4f），包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝和脂質代謝途徑等。除脂肪酸氧化和其他與脂質代謝相關的途徑外，咪唑乙酸和丙酮酸水平的升高與血液中紅細胞數量、HCT和HGB水平呈負相關。它可能通過碳水化合物和氨基酸代謝，如TCA循環和糖酵解/糖異生兩種額外的能量代謝，參與pt-DVT的發病機制。
6.機器學習識別pt-DVT血液代謝物的生物標志物
為了驗證預測模型的泛化能力，研究者對來自獨立驗證隊列的100名參與者進行了代謝組學分析。如圖5a-b所示，僅使用CPs預測pt-DVT的模型1的表現最差，表明目前僅使用CPs可能不足以診斷pt-DVT。相應地，模型2（僅代謝物）和模型3（CPs和代謝物）能夠有很好地區分效果，這表明血漿代謝物在臨床使用中對pt-DVT的早期診斷和預測有很大的貢獻。特別是，包含9種代謝物（十六烷二酸、丙酮酸、L-Carnitine、5 -羥色胺、5,6-DHET、3-羥基癸酸、PE(P−18:1(11Z)/18:2(9Z,12Z))、3-甲氧基苯丙酸和戊腈）（圖5c）的模型2在發現隊列和驗證隊列中的表現都優于其他模型，表明具有更好的可預測性和泛化能力。
圖5.機器學習識別pt-DVT特征代謝物
7.代謝組學和蛋白質組學分析揭示了pt-DVT的潛在治療策略
考慮到蛋白質組學可以通過分析蛋白的代謝過程提供深刻的代謝視角，并有助于理解pt-DVT代謝，研究者對來自隊列的96名pt-DVT患者和87名對照參與者進行了一項蛋白組學研究。總共定性定量了524個血漿蛋白，214個蛋白被鑒定為兩組差異蛋白，其中pt-DVT患者中153個蛋白表達上調，61個蛋白表達下調（圖6a）。差異蛋白富集的KEGG通路發現，pt-DVT患者中有15條通路發生顯著改變（圖6b）。值得注意的是，補體和凝血級聯被認為是改變最顯著的途徑，這也是直接傳遞到DVT的調節途徑。
結合代謝組學和蛋白質組學的結果，發現糖酵解/糖異生在代謝物和蛋白質水平上都發生了變化。糖酵解/糖異生產生丙酮酸用于TCA循環，而本研究發現，pt-DVT患者體內丙酮酸、檸檬酸和糖酵解/糖異生途徑中的幾種蛋白質均顯著增加。因此，有理由推測，糖酵解/糖異生的上調可能導致血栓形成的發病機制。這促使研究者通過整合代謝組學和蛋白質組學數據，進一步探索糖酵解/葡萄糖生成的作用。
如圖6c所示，發現丙酮酸上游的8個蛋白（LDHA、LDHB、GAPDH、GPI、PKM、MINPP1、ENO1和TPI1）在pt-DVT患者中顯著上調。丙酮酸級聯的糖酵解/糖異生-TCA循環是產生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nictinamide Adenine Dinucleotide, NADH)的主要來源，在細胞氧化還原狀態中起著至關重要的作用。已有研究表明，紅細胞中的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)會改變紅細胞膜結構，并在血栓形成時影響增強。與這些報道一致，本研究數據表明，ROS相關的過氧化物酶在pt-DVT中受到輕微干擾，PRDX5上調，PRDX2下調。此外，糖酵解/糖異生途徑中變化最顯著的蛋白乳酸脫氫酶(LDHA/LDHB)，參與多種細胞的活性氧生成。研究者推測，糖酵解/糖異生-TCA循環級聯的上調可能與紅細胞中ROS的積累有關，從而增強血栓形成。
總之，代謝組學和蛋白質組學數據強調了干預糖酵解/糖異生和氧化還原穩態可作為pt-DVT的潛在治療靶點。
圖6.代謝組學和蛋白質組學分析揭示了pt-DVT的潛在治療策略
基于這些結果，研究者還對數據中與糖酵解/糖異生和氧化還原穩態相關的蛋白進行了藥理學分析，并確定了50種靶向糖酵解/糖異生和氧化還原穩態的潛在化合物，從而促進了后續的功能研究和藥物開發。
研究結論
本隊列研究確定了28種代謝物和14種CPs與pt-DVT顯著相關，并全面證明了pt-DVT患者血液中代謝和CPs的改變。基于這些顯著改變的代謝物和CPs，研究者開發了一個由9種代謝物組成的組合，以有效區分pt-DVT患者。更重要的是，結合蛋白質組學數據，發現丙酮酸級聯的糖酵解/糖異生-TCA循環的上調可能促進血栓形成，調節紅細胞中的ROS水平。這表明干擾糖酵解/糖異生和氧化還原穩態可能是pt-DVT治療的潛在治療策略。
總的來說，本研究表征了pt-DVT的代謝失調，并通過大規模隊列確定了血漿生物標志物。本研究的發現可以促進pt-DVT的功能研究，并有助于臨床應用的早期診斷。
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END
張茗心 撰文
Tang 校稿
