在qPCR實(shí)驗(yàn)中，CT值（Cyclethreshold，閾值循環(huán)數(shù)），即起始模板擴(kuò)增達(dá)到一定產(chǎn)物量時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，是判斷目標(biāo)基因表達(dá)量的關(guān)鍵指標(biāo)。然而，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常常會(huì)遇到CT值異常的情況，比如CT值過(guò)高（信號(hào)過(guò)弱）、CT值過(guò)低（信號(hào)過(guò)強(qiáng)）、重復(fù)性差。
這三種異常往往由多種原因造成，接下來(lái)我們將逐個(gè)對(duì)潛在的原因進(jìn)行分析，并提出解決方案。
CT值過(guò)高
1.模板降解或濃度過(guò)低：
RNA/cDNA降解或濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致CT值過(guò)高。
解決方案：
RNA/cDNA質(zhì)量檢測(cè)：電泳檢查RNA完整性（28S:18S≈2:1）；測(cè)A260/A280（1.8-2.0）和A260/A230（>2.0）。
優(yōu)化模板濃度：適當(dāng)增加cDNA量（但避免過(guò)量導(dǎo)致抑制）。
2.退火溫度過(guò)高：
當(dāng)退火溫度設(shè)置高于引物-模板實(shí)際結(jié)合的最適溫度時(shí)，引物與模板結(jié)合效率下降，有效擴(kuò)增起始分子數(shù)減少，進(jìn)而導(dǎo)致CT值增大。
解決方案：
調(diào)整反應(yīng)程序：降低退火溫度。
3.PCR抑制物干擾：
乙醇、SDS、酚等殘留抑制Taq酶活性，擴(kuò)增效率降低，會(huì)導(dǎo)致CT值偏高。
解決方案：
純化模板：使用柱式純化或乙醇沉淀去除抑制劑。
稀釋cDNA：1:5或1:10稀釋，減少抑制物影響。
CT值過(guò)低
1.模板濃度過(guò)高：
模板濃度過(guò)高，導(dǎo)致熒光信號(hào)過(guò)早達(dá)到閾值。
解決方案：對(duì)模板進(jìn)行梯度稀釋，重新實(shí)驗(yàn)，確保CT值落在合理范圍（如15-30之間）。
2.引物特異性差或形成二聚體：
這兩種原因?qū)е碌姆翘禺愋詳U(kuò)增會(huì)使CT值過(guò)低。
解決方案：
重新設(shè)計(jì)引物：使用PrimerBLAST或Oligo7優(yōu)化引物特異性；避免引物二聚體（3'端避免互補(bǔ)）。
3.反應(yīng)條件設(shè)置不合理：
反應(yīng)條件優(yōu)化過(guò)度，導(dǎo)致擴(kuò)增效率遠(yuǎn)超100%。
解決方案：
驗(yàn)證擴(kuò)增效率：制作反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確保斜率在3.1-3.6（即擴(kuò)增效率90-110%）。
優(yōu)化退火溫度：梯度PCR確定最佳Tm值，適當(dāng)提高溫度減少非特異擴(kuò)增。
4.氣溶膠或交叉污染：
反應(yīng)體系被外源核酸污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性擴(kuò)增。
解決方案：
污染防治：更換試劑、耗材，并使用無(wú)模板陰性對(duì)照（NTC）監(jiān)控污染。
CT值重復(fù)性差
1.反應(yīng)體系設(shè)置不合理：
ROX參比染料和儀器要求不匹配，會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)不穩(wěn)。
解決方案：
檢查ROX校正：確保儀器設(shè)置與試劑匹配，根據(jù)儀器要求選擇相應(yīng)ROX含量的試劑。
2.模板不均一：
模板不均一會(huì)導(dǎo)致qPCR復(fù)孔CT值差異大，尤其對(duì)于低拷貝樣本。
解決方案：
提高模板量：盡可能增加模板量，使CT值落在15-30之間。
充分混勻：模板解凍后渦旋、短暫離心；體系分裝前整體預(yù)混并再次混勻，減少樣本間誤差。
增加復(fù)孔數(shù)：低豐度樣本建議4–6孔。
3.操作誤差：
加樣誤差會(huì)導(dǎo)致CT值重復(fù)性差。
解決方案：
精確加樣：使用排槍或低吸附槍頭，減少誤差。
其他注意事項(xiàng)
每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置內(nèi)參基因（如GAPDH、β-actin），確保數(shù)據(jù)可靠性。
使用無(wú)核酸酶水，避免RNA降解。
定期校準(zhǔn)qPCR儀，確保熒光檢測(cè)準(zhǔn)確。
qPCR實(shí)驗(yàn)的CT值異常并不可怕，關(guān)鍵在于合理排查。相信按照上述方案進(jìn)行優(yōu)化，你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一定會(huì)更加穩(wěn)定可靠。如果有遇到其他CT值相關(guān)問(wèn)題，也歡迎留言討論哦。
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