高靈敏度支原體檢測試劑盒說明書
【產品規格】
BPMPro100 100 Reactions/盒
【產品說明】
支原體(Mycoplasma)：目前發現的最小原核生物，據統計約15~35% 的細胞被支原體污染。支原體污染會改變宿主細胞的結構與功能，易致實驗結果不穩定，須對培養細胞定期進行支原體檢測。
本試劑盒采用雙色熒光 qPCR (TaqMan 探針法) 檢測支原體DNA。檢測對象為細胞培養的上清液，細胞沉淀或其他生物制品。該試劑盒具有以下特點：
靈敏：配合推薦使用的核酸抽提方案，檢測靈敏度達到10CFU/ml。
可靠：抽提加入內標核酸，全過程質量控制。
穩定：全程閉管操作，無交叉污染。
方便：操作簡單，無需電泳步驟。
【有效期】
規定儲存條件下6個月。
-20 ℃取出后，可避光存放于4 ℃繼續使用1周。
【產品組分】
表1 產品組分
| 組分名稱 | 裝量 | 儲存條件 |
|---|---|---|
| Biowing? MyqPCR Reaction Mix1 | 475 ul×2管 | -20 ℃，避光 |
| Biowing?MyPrimer&Probe Mix2 | 25 ul×2管 | -20 ℃，避光 |
| 陽性質控（PC) | 50 ul×2管 | -20 ℃ |
| 內部質控（IC) | 50 ul×2管 | -20 ℃ |
| RNase Free Water | 50 ul×2管 | -20 ℃ |
| 石蠟油 | 750 ul×2管 | -20 ℃ |
注：
1、陽性質控含有支原體DNA和內標DNA。
- 內部質控含有內標DNA。
在實驗前請完整閱讀本說明書，務必重視注意事項和無菌操作規范！
【操作步驟】
1.樣本制備
- 樣本的標準制備方案：請配合使用高效無微生物污染的DNA抽提試劑盒提取樣本DNA。整個過程需要遵守無菌操作規范。本公司目前推薦抽提試劑盒見附錄3。直接取20 μL待測樣本DNA，作為模板進行 qPCR 反應。
- 前處理陰性樣本準備方案：將RNase Free Water當成樣本，加入內部質控，進行核酸抽提。
- qPCR 反應液的準備
- 根據所要檢測樣品的數量，計算所需反應孔數，每個樣本做3個重復孔。
反應孔數=1個陽性PCR質控+1個陰性PCR質控+1個前處理陰性質控+樣本數×?3 - 根據反應孔數計算所需的qPCR Mix 總量（需有1孔的加樣損失量）：
Mix =（反應孔數+1）×10 μl - 各試劑放室溫融化，并根據下表所示準備 qPCR Mix：
表2 qPCR Mix的配制
| 組分/樣品管 | Biowing? MyqPCR Reaction Mix1 (μL) | MyPrimer&Probe Mix2(μL) | 總體積(μL) |
|---|---|---|---|
| 1人份 | 9.5 | 0.5 | 10 |
| N人份 | 9.5N | 0.5N | 10N |
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- 加樣
（1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。
（2）向每孔反應管中分裝 10 μL qPCR Mix。
（3）向已分裝過 qPCR Mix 的反應管中加入15 ul石蠟油。
（4）向反應管中加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：
表 3 加樣示例
| PCR模板 | qPCR Mix | 總體積 |
|---|---|---|
| PC 20 μL | 10 μL | 30 μL |
| qPCR 陰性20 μL | 10 μL | 30 μL |
| 前處理陰性20 μL | 10 μL | 30 μL |
| 樣本A重復1 20ul | 10 μL | 30 μL |
| 樣本A重復2 20ul | 10 μL | 30 μL |
| 樣本A重復3 20ul | 10 μL | 30 μL |
【注】：此時每個反應孔的體積為30μL。
qPCR 陰性的PCR模板為20 ul RNase Free Water。
PCR 儀設置以 ABI 7500 為例，相對定量模式，選擇
TaqMan?探針法：
| 步驟 | 循環數 | 溫度 | 時間 | |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 預變性 | 1 | 94℃ | 5 min |
| 2 | 變性 | 15 | 95℃ | 10 s |
| 退火與延伸 | 65℃ | 90 s | ||
| 3 | 變性 | 25 | 95℃ | 10 s |
| 退火與延伸 | 65℃ | 30 s | ||
| 65℃延伸時收集熒光信號 | ||||
| 通道選擇：樣本檢測通道-FAM；內參檢測通道-HEX，無HEX 通道，可使用VIC 通道。ABI 系列熒光定量 PCR 儀需 ROX 校準，Passive reference 選擇ROX。 |
注：1、該程序為兩階段擴增法，如熒光定量PCR儀可以兩階段收集熒光，按照正常Ct值判斷結果；如果只能最后一步收集熒光，需要在原數據的基礎上加15個Ct值。
- ROX設置是以7500為例，但也存在例外，例如StepOne。
【閾值設置】
以ABI 7500 為例，擴增曲線選擇 log 法，如果不能兩階段收集熒光，基線設置1~2個循環；如果可以，基線設置3-15個循環。建議用 log 法擴增曲線保證結果穩定可靠。
- 內參(HEX/VIC)閾值設定：以陽性對照定內參擴增曲線閾值，將內參的Ct 值定為 28±2。
- 支原體(FAM)閾值設定：以陽性對照定支原體擴增曲線閾值，將支原體(FAM)的 Ct 值定為 28±2 。
【實驗質量控制】：
如果陽性對照管的支原體(FAM)Ct 值>30，但陽性對照管及前處理陰性對照管的內參(HEX)Ct 值正常，表明陽性支原體對照模板有降解。
如果樣品前處理陰性的內參（HEX/VIC)Ct 值>30，陽性對照管的內參(HEX)Ct 值>30 ，表明內參DNA存在降解或PCR體系擴增效率下降。
【結果判讀】
根據支原體(FAM) Ct 值、內標(VIC) Ct 值判定，具體標準如下：
| PCR 模板 | 支原體(FAM)Ct 值 | 內標(VIC) Ct 值 | 判定說明 |
|---|---|---|---|
| 陽性對照 | ≤30 | － | 陽性成立 |
| >30 | － | 陽性不成立 | |
| qPCR陰性對照 | ≥37.5 | ≥37.5 | 陰性成立 |
| ＜37.5 | ＜37.5 | 陰性不成立 | |
| 樣本前處理陰性 | ≥37.5 | ≤30 | 陰性成立 |
| 待測樣品反應孔 | ＜37.5 | ≤30 | 陽性 |
| ≥37.5 | ≤30 | 陰性 |
要求每個檢測樣品做3重復，如果3復孔中，兩重復為陽性，則判讀為陽性；建議做樣本前處理陰性，可以質控整個抽提過程。
注：檢測結果異常時：
- 樣品前處理陰性：內參Ct值過大，表明抽提效率低；支原體檢測通道Ct值小于37.5，可能前處理抽提過程存在污染。
- qPCR陰性：支原體和內參檢測通道Ct值小于37.5，操作過程存在污染。
- 樣本前處理陰性質控和PCR陽性質控內參差1±1個Ct值屬于正常現象。
【 PCR過程注意事項】
由于 PCR 反應非常靈敏，實驗操作中應注意以下事項，以免發生DNA 污染：
- 試劑盒開啟后，陽性質控和內部質控與試劑Biowing? MyqPCR Reaction Mix1、Biowing?MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蠟油分開存放。
- 每個組分在使用前都應先低速離心后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。
- 要求核酸抽提和qPCR過程都符合無菌操作規范。
- 建議自備轉運盒，用于將配制分裝好的Mix從配置Mix超凈工作臺轉運到加樣超凈工作臺。
- 建議在 qPCR 反應板上陽性對照的排布應遠離待測樣本和陰性對照。
- 建議 qPCR 配置與分裝在一個無菌操作臺，樣本的加樣在另外一個無菌操作臺。
- 建議使用不同的移液器添加陽性對照與待測樣本、陰性對照，并使用帶濾芯的槍頭進行加樣。
- 應按照先加陰性，再加樣本，最后加陽性的順序加樣。且陽性用專門的加樣器。建議陽性在專門的無菌操作臺加樣。
- qPCR 反應板封膜或蓋蓋子時須反復壓緊。
- 上機擴增前，反應管短時低速離心，將管壁液體收集至管底
- 蓋上反應管蓋子或者貼上光學膜后，為避免影響熒光信號讀取，請注意不要在管蓋或者膜上做標記，或者用刮板反復摩擦。
- 本產品僅作科研用途。
【附錄 1 可檢測支原體種類】
| 序號 | 拉丁文系統名 | 序號 | 拉丁文系統名 |
|---|---|---|---|
| 1 | Acholeplasma hippikon | 46 | Mycoplasma orale |
| 2 | Acholeplasma laidlawii | 47 | Mycoplasma ovipneumoniae |
| 3 | Acholeplasma oculi | 48 | Mycoplasma oxoniensis |
| 4 | Acholeplasma pleciae | 49 | Mycoplasma penetrans |
| 5 | Candidatus Mycoplasma girerdii | 50 | Mycoplasma phocicerebrale |
| 6 | Mycoplasma alkalescens | 51 | Mycoplasma phocidae |
| 7 | Mycoplasma alvi | 52 | Mycoplasma pirum |
| 8 | Mycoplasma anseris | 53 | Mycoplasma pneumoniae |
| 9 | Mycoplasma anserisalpingitidis | 54 | Mycoplasma pulmonis |
| 10 | Mycoplasma aquilae | 55 | Mycoplasma salivarium |
| 11 | Mycoplasma arginini | 56 | Mycoplasma sp. Phocoena |
| 12 | Mycoplasma arthritidis | 57 | Mycoplasma sphenisci |
| 13 | Mycoplasma auris | 58 | Mycoplasma struthionis |
| 14 | Mycoplasma bovoculi | 59 | Mycoplasma sualvi |
| 15 | Mycoplasma buccale | 60 | Mycoplasma subdolum |
| 16 | Mycoplasma canadense | 61 | Mycoplasma synoviae |
| 17 | Mycoplasma cloacale | 62 | Mycoplasma testudineum |
| 18 | Mycoplasma conjunctivae | 63 | Mycoplasma testudinis |
| 19 | Mycoplasma crocodyli | 64 | Mycoplasma timone |
| 20 | Mycoplasma dispar | 65 | Mycoplasma todarodis |
| 21 | Mycoplasma elephantis | 66 | Mycoplasma tullyi |
| 22 | Mycoplasma enhydrae | 67 | Mycoplasma verecundum |
| 23 | Mycoplasma equigenitalium | 68 | Mycoplasma vulturii |
| 24 | Mycoplasma falconis | 69 | Mycoplasma zalophi |
| 25 | Mycoplasma faucium | 70 | Mycoplasmopsis agassizii |
| 26 | Mycoplasma felis | 71 | Mycoplasmopsis alligatoris |
| 27 | Mycoplasma flocculare | 72 | Mycoplasmopsis anatis |
| 28 | Mycoplasma gallisepticum | 73 | Mycoplasmopsis arginini |
| 29 | Mycoplasma gateae | 74 | Mycoplasmopsis bovirhinis |
| 30 | Mycoplasma genitalium | 75 | Mycoplasmopsis canis |
| 31 | Mycoplasma gypis | 76 | Mycoplasmopsis citelli |
| 32 | Mycoplasma hominis | 77 | Mycoplasmopsis columbinum |
| 33 | Mycoplasma hyopharyngis | 78 | Mycoplasmopsis cricetuli |
| 34 | Mycoplasma hyorhinis | 79 | Mycoplasmopsis cynos |
| 35 | Mycoplasma hyosynoviae | 80 | Mycoplasmopsis edwardii |
| 36 | Mycoplasma imitans | 81 | Mycoplasmopsis felis |
| 37.5 | Mycoplasma indiense | 82 | Mycoplasmopsis fermentans |
| 38 | Mycoplasma leocaptivus | 83 | Mycoplasmopsis gallinacea |
| 39 | Mycoplasma leonicaptivi | 84 | Mycoplasmopsis mustelae |
| 40 | Mycoplasma lipophilum | 85 | Mycoplasmopsis pullorum |
| 41 | Mycoplasma marinum | 86 | Mycoplasmopsis pulmonis |
| 42 | Mycoplasma moatsii | 87 | Mycoplasmopsis verecunda |
| 43 | Mycoplasma mobile | 88 | Ureaplasma diversum |
| 44 | Mycoplasma nasistruthionis | 89 | Ureaplasma felinum |
| 45 | Mycoplasma neophronis | 90 | Ureaplasma urealyticum |
【附錄 2 適用熒光定量 PCR 儀品牌型號】
| 序號 | 生產商 | 機器型號 |
|---|---|---|
| 1 | ABI | 7500 |
| 2 | ABI | 7500 Fast DX |
| 3 | ABI | StepOnePlus |
| 4 | ABI | QuantStudio5 |
| 5 | ABI | StepOne |
| 6 | ABI | QuantStudio7 |
| 7 | ABI | VIVA7 |
| 8 | ABI | QuantStudio 3 |
| 9 | Roche | Roche LightCycler96 |
| 10 | Roche | Roche LightCycler480 |
| 11 | Biorad | Bio-Rad CFX96 |
| 12 | 宏石 | SLAN-96S/48P |
注：適用熒光定量PCR 儀為迄今為止我們客戶配備的定量儀器品牌型號，如您的熒光定量 PCR 儀不在我們列出的范圍，也歡迎聯系我們，申請試用。
如有技術問題，歡迎電話咨詢：021-33559491
【附錄 3 高靈敏度支原體 DNA 提取純化試劑盒（柱式法）說明書】
本公司推薦QIAGEN公司的QIAamp UCP Pathogen Mini Kit (50)
貨號： 50214
- 試劑盒簡介
支原體 DNA 提取純化試劑盒（柱式法）用于提取純化生物樣品中的微量支原體 DNA，與高靈敏度支原體檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）配套使用，參照EP2.6.7 和 JPXVII 支原體檢測相關要求進行驗證。 - 試劑盒組分
表 1. 試劑盒組分
| 組份 | 裝量 | 儲存條件 |
|---|---|---|
| Collection Tubes (2 ml) | 50個×1 袋 | 室溫 |
| Elution Tubes (1.5 ml) | 50個×1 袋 | 室溫 |
| UCP Mini Columns | 1個×50 | 2~8℃ |
| Buffer ATL | 38ml×1 瓶 | 室溫 |
| Buffer APL2 | 14ml×1 瓶 | 室溫 |
| Buffer APW1 | 18ml×1 瓶 | 室溫 |
| Buffer APW2 | 15ml×1 瓶 | 室溫 |
| Buffer AVE | 1.9ml×8管 | 室溫 |
| Proteinase K | 2.5ml×1 瓶 | 2~8℃ |
注：在室溫(15-25℃)下儲存，蛋白酶K可穩定達1年。延長蛋白酶K的壽命，建議儲存在2-8℃。
在實驗前請完整閱讀本說明書，務必重視注意點！
- 實驗準備
開啟新試劑盒時需完成以下工作： - 將樣品置于室溫(15–25°C)平衡。
- 將Buffer AVE置于室溫平衡。
- 配制Buffer APW1：使用前，將24 ml乙醇(96-100%)加入18 ml Buffer APW1濃縮液中，得到42 ml Buffer APW1。加入乙醇后震蕩混勻。
- 配制Buffer APW2 ：使用前，將35 ml乙醇(96-100%)加入15 ml Buffer APW2濃縮液中，得到50 ml Buffer APW2。加入乙醇后震蕩混勻。
- 如果Buffer ATL或Buffer APL2中形成沉淀，應56 ℃水浴或金屬浴，待完全溶解后，震蕩混勻。
- 準備好 2個水浴或金屬浴溫度，56 ℃、70 ℃。
在樣品準備時需要注意以下幾點： - 陰性對照（NCS）：每次實驗中都需要用稀釋液設置一個 NCS 作為對照樣品，NCS 與其他待測樣品一起進行 DNA 的提取和純化操作，以評估在樣品處理過程中各操作步驟是否正確，是否存在樣品交叉污染或環境污染的情況。
制備步驟如下：取 1.5 ml 無菌低吸附離心管，加入400μl無菌水，再加入6 μl IC，混勻。 - 待測樣品：在提取支原體樣品之前將 IC 添加到樣品中，可以作為整個實驗過程的質控。制備步驟如下：取 1.5 ml 無菌低吸附離心管，加入 400 μl 樣品，再加入 6μl IC，混勻。
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- 樣品處理
根據樣品的體積不同分為兩種不同的方式進行處理：對于小于 400 μl 樣品不需要濃縮，直接進行后續的 DNA 提取純化實驗；對于大體積（400 μl~2 ml）的樣品應先離心濃縮至 400 μl，再進行后續的 DNA 提取純化實驗。具體方法步驟如下：
1、小體積樣品（≤ 400 μl）
取 400μl 樣品（細菌小于2×109或細胞小于5×107）于 1.5 ml 無菌低吸附離心管中。
2、大體積樣品（400 μl~2 ml）
根據是否需要檢測樣品細胞中的支原體情況，可以選擇離心濃縮方式進行：
離心濃縮
- 取離心去除細胞后的上清，于 4 ℃ 15000 rpm 離心 30min，沉淀支原體顆粒。
- 離心后，小心用移液槍緩慢吸出上清。注意吸取速度不可太快，槍頭不可觸碰支原體沉淀顆粒。切忌采用直接傾倒的方式去除上清，以免造成損失。
- 加入 400 μl ATL，用移液槍吹打或渦旋重懸支原體沉淀，并輕微離心， 將管壁等上面的液滴離心下來。
- 將上述重懸液轉移至 1.5 ml 無菌低吸附離心管中。
注意樣品預處理好后需盡快進行下述的DNA 提取實驗
操作過程
- 在400μl已預處理的樣品中加入6ul 內部質控DNA、40μl蛋白酶K（Proteinase K），渦旋震蕩10秒以充分混合。
- 56°C孵育樣品20分鐘。
- 加入200μl Buffer APL2，關上管蓋渦旋振蕩30秒。（注意：為了確保足夠的裂解，必須將樣品和緩沖液APL2充分混合。）
- 70°C孵育20分鐘。
- 瞬時離心將管壁上的液滴流回管底。
- 加入300 μl乙醇。關上管蓋，渦旋振蕩15-30秒以充分混勻。
- 小心的吸取600 μl步驟6中的液體，轉移至QIAamp UCP Mini spin column（放在2ml的收集管中），注意不要弄濕吸附柱上緣。關上管蓋，6000 x g (8000 rpm)離心1分鐘。把吸附柱轉移到一個新的2ml收集管中，棄去舊的收集管。
- 將步驟6中剩余的液體加入吸附柱，重復步驟7。
- 在吸附柱內小心的加入600μl Bufffer APW1，注意不要弄濕吸附柱上緣。關上管蓋，6000 x g (8000 rpm)離心1分鐘。把吸附柱轉移入一個新的2ml收集管，棄去舊的。
- 小心的打開吸附柱蓋，加入750μl Buffer APW2，注意不要弄濕吸附柱上緣。關上管蓋，用最大離心速度（20000 x g；12000rpm）離心3分鐘。
- 建議步驟：將吸附柱放入一個新的2ml收集管，棄去舊的。以最大速度離心1分鐘。這一步有助于去除buffer APW2的殘留。
- 將吸附柱放入一個新的2ml收集管，打開管蓋，56°C加熱3分鐘使膜充分干燥。
- 將吸附柱放入一個干凈的2ml收集管中，棄去舊的收集管。小心的在吸附柱膜中央加入35μl Buffer AVE。關上管蓋，室溫孵育1分鐘。
- （注意：確保Buffer AVE平衡到室溫。如果以小體積(<50 μl)進行洗脫，則必須將Buffer AVE加到膜的中心，以完全結合DNA。洗脫體積可根據下游應用的要求進行調整。回收的洗脫液體積，比加在column上的洗脫液體積少5 μl。）
- 以最大離心速度（20000 x g ； 12000 rpm）離心1分鐘，洗脫核酸。
- 重復步驟13和14。
注：洗脫體積為70ul
核酸抽提注意事項
- 請盡量在完成樣品純化處理當天進行后續的 DNA 檢測，以保證檢測結果的準確性。
- 由于支原體為病原微生物，提取純化操作過程建議在二級生物安全實驗室或安全柜中進行。
- 不要將漂白劑或酸性溶液直接添加到含有緩沖APL2或緩沖APW1。如果含有這些緩沖液的液體溢出，用合適的實驗室洗滌劑和水清洗。如果濺出的液體含有潛在的傳染因子，先用實驗室洗滌劑加清水清洗，再加1% (v/v)次氯酸鈉清洗。
樣品制備期間: - 小心地將樣品溶液加到核酸吸附柱上。槍頭中的樣品進入核酸吸附柱而不濕潤柱的邊緣。
- 不同液體在轉移之間更換槍頭。使用帶濾芯的槍頭
- 避免用槍頭接觸核酸吸附膜。
操作環境及相關設備耗材 - 實驗所需但試劑盒中未含材料
- RNase Free Water
- 無水乙醇（分析純）
- PCR 8 連管或 96 孔板，相應管蓋或覆膜
- 1000μl，100μl，10μl 無菌低吸附濾芯槍頭
- 1.5ml，2ml 無菌低吸附離心管
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- 相關設備
- 迷你離心機
- 漩渦振蕩器
- 恒溫水浴鍋或金屬浴鍋
- 1000μl，100μl，10μl 移液槍
- 熒光定量 PCR 儀
- 生物安全柜
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無菌操作規范
1、除高速離心機外，其他設備和耗材應放在無菌操作臺中，保證無菌。
2、樣本高速離心后，要對離心管噴酒精，并用棉球擦拭離心管外壁，同時更換干凈的板架和新手套。
3、實驗前用75%酒精擦凈臺面及四周，放好需用的實驗器材及各種溶液，并用酒精棉球擦拭，更換干凈的管架。
4、對著桌面，空間噴灑酒精，然后將超凈工作臺通風機打開，超凈工作臺和紫外燈打開 30～45 分鐘，再將無菌室紫外燈打開 30～45 分鐘后關閉，再通風 15 分鐘。關閉紫外，拉開小一半隔離，用酒精棉球擦拭超凈工作臺桌面2遍，關上隔離。
5、進入無菌室操作前，雙手及在操作臺內手臂部分用75%的酒精擦拭消毒。穿專用工作服、帽及拖鞋、口罩，應放在無菌室緩沖間，工作前經紫外線消毒后使用。
6、無菌室溫度宜控制在 18～28℃，濕度在 45%～65%（溫濕度計應該用無水的）。
7、從槍頭盒中取出槍頭時，尖部不能觸及外露部位及離心管和管架邊。
8、操作盡量在酒精燈前操作。打開離心管前，酒精燈灼燒鑷子，待冷卻后用鑷子開關管蓋。
9、操作中，不能在樣品上方翻轉瓶蓋，袖口不能掠過樣品上方。
10、實驗完畢，清潔臺面。
11、實驗者在實驗后用肥皂清洗雙手。
12、換下的專用實驗服，進行紫外線，一次性鞋套額帽子扔進垃圾桶。
13、用畢，再開紫外燈消毒 30分鐘。
14、無菌室和緩沖間定期大掃除，保持整潔。
15、定期檢查紫外燈燈管。每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。如燈管發黑，超過使用期限，及時更換紫外燈管。
2、注意事項
(1)工作臺面上，禁止存放不必要的物品，以保證工作區域內的潔凈氣流不受干擾。
(2)禁止在工作臺面上記錄，工作時應盡量避免作明顯擾亂氣流的動作。(3)根據環境潔凈度，每 3~6 個月將中效過濾器中的濾料拆下清洗。一般情況下，當無紡布濾料容納塵埃較多、表面發黑時即可拆下進行清洗，或者予以更換。
(4)風機轉速調至最大時，仍不能達到所需要的風速時（即風速≤0.2m/s）,則必須更換高效空氣過濾器。說明書