單克隆抗體可識(shí)別特定的抗原決定簇，可與相應(yīng)抗原結(jié)合，用于診斷或治療疾病。隨著技術(shù)手段的日新月異，出現(xiàn)了很多成熟的單抗制備方法。單抗制備的首次突破是1975年開(kāi)發(fā)的雜交瘤技術(shù)。除此之外，目前還有愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒（EBV）永生化技術(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)和單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)等。
單B細(xì)胞抗體制備技術(shù)的起源
1996年，Babcook等首次報(bào)道了一種抗體制備的新方法，該方法利用免疫球蛋白（Immunoglobulin，lg）的可變區(qū)互補(bǔ)DNA（Complementary DNA，cDNA）進(jìn)行分子克隆和抗體表達(dá)。首先，通過(guò)特異性溶血空斑試驗(yàn)篩選產(chǎn)生特定抗體的單個(gè)B細(xì)胞，并從中提取可變區(qū)DNA；然后，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增和回收重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，并連接到人源Ig恒定區(qū)基因進(jìn)行表達(dá)，最終獲得特異性抗體。現(xiàn)已應(yīng)用該技術(shù)成功制備了大量人源單抗并廣泛用于疾病的診斷和治療。單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于抗腫瘤治療和抗病毒治療，如寨卡病毒和流感病毒等，且在抗擊新冠疫情時(shí)發(fā)揮了重要作用。
單B細(xì)胞抗體制備技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)
不同單抗制備技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)如下表所示，單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)是基于Ig基因譜系分析和單細(xì)胞水平的Ig反應(yīng)性分析相結(jié)合的方法，利用細(xì)胞分選和測(cè)序技術(shù)，僅需很少的細(xì)胞便可以得到表達(dá)抗體的基因，再通過(guò)體外表達(dá)即可在短時(shí)間內(nèi)迅速產(chǎn)生大量抗原特異性單抗。
單B細(xì)胞抗體制備的流程
單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)主要包括以下步驟：
(1)對(duì)主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫過(guò)的人或其他動(dòng)物進(jìn)行外周血分離，體型較小的動(dòng)物可以選擇分離脾臟；
(2)對(duì)外周血或脾臟中的B細(xì)胞進(jìn)行富集以提高分選效率；
(3)對(duì)富集的B細(xì)胞進(jìn)行特異性分選；
(4)對(duì)分選的單個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解以釋放其中的核酸；
(5)將核酸進(jìn)行RT-PCR，反轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)的mRNA；
(6)根據(jù)表達(dá)抗體重鏈可變區(qū)(Variable heavy chain, VH)和輕鏈可變區(qū)(Variable light chain, VL)的基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得可變區(qū)序列；
(7)將可變區(qū)序列插入帶有恒定區(qū)基因的載體質(zhì)粒,獲得單抗表達(dá)質(zhì)粒；
(8)選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，獲取抗體。
單B細(xì)胞抗體制備技術(shù)的應(yīng)用
單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前抗體研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。該技術(shù)具有快速、高效、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，表達(dá)的抗體具有天然構(gòu)象，在治療病原微生物感染、腫瘤研究、免疫系統(tǒng)研究等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛。在治療病原微生物感染方面，Tajiri等利用該技術(shù)制備了多株針對(duì)乙肝病毒的單抗，其中50%以上具有中和活性，有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)乙肝疾病的單抗治療方法。Zost等利用該技術(shù)平臺(tái)成功制備了上百株針對(duì)SARS-CoV-2Spike蛋白的人源單抗，其中多株單抗可以中和病毒，達(dá)到抑制病毒感染的效果。在腫瘤研究方面，Iizuka等利用該技術(shù)成功制備了人源黑色素瘤的單抗，為后續(xù)開(kāi)發(fā)黑色素瘤治療性單抗提供了技術(shù)支撐。Gilbert等利用該技術(shù)平臺(tái)獲得對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有殺傷作用的抗黑色素瘤單抗，建立了具有良好敏感型的新型ELISA檢測(cè)方法。在免疫系統(tǒng)研究方面該技術(shù)可將所有B細(xì)胞單獨(dú)分離，結(jié)合二代測(cè)序等技術(shù)對(duì)B細(xì)胞重輕鏈基因庫(kù)進(jìn)行整合分析，從而對(duì)整個(gè)免疫系統(tǒng)和免疫機(jī)理進(jìn)行探究。
單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)以其快速、高效和高產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注，但也面臨一些挑戰(zhàn)，如技術(shù)復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用。德泰生物SingleB®單B細(xì)胞快速單抗發(fā)現(xiàn)服務(wù)，利用SmartFlow®FACS記憶B細(xì)胞選平臺(tái)與Deeplight®漿細(xì)胞雙篩選平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)記憶B細(xì)胞與漿細(xì)胞的雙篩選。平臺(tái)適用于小鼠、兔、羊駝、人源化小鼠、綿羊等多種免疫對(duì)象，從動(dòng)物免疫到獲得單抗，快至29天，比傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)至少節(jié)省120天。
參考文獻(xiàn)
楊鄭欣,李琰,張曉茜,等.單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2023, 59(8):82-87.