一、背景及應用介紹
支原體是一類沒有細胞壁、形態多變、尺寸極小的簡單原核生物。它們既是重要的人類和動物病原體，也是細胞培養中棘手且危害巨大的污染物。有報道顯示Giemsa染色血細胞感染支原體，SEM透射電鏡，以及激光共聚焦Confocol染色觀察細胞感染支原體[1,2,3]。見圖1，2。
圖1
圖2
支原體對細胞治療產品的具體危害：
1. 對細胞本身的影響
（1）改變細胞生物學功能：與細胞競爭營養，分泌代謝廢物，抑制細胞增殖和代謝，甚至導致細胞死亡。
（2）干擾細胞基因表達：改變宿主細胞的DNA、RNA和蛋白質合成，可能導致治療性細胞（如CAR-T細胞、干細胞）關鍵功能喪失（如殺傷腫瘤能力、分化潛能）。
（3）引起遺傳不穩定性：可能導致宿主細胞染色體畸變，帶來不可預見的風險。
2. 對患者的風險
（1）引發全身性感染：細胞產品被直接回輸至患者體內，大量支原體可導致敗血癥或菌血癥，對免疫系統脆弱的患者是致命威脅。
（2）加劇細胞因子釋放綜合征（CRS）：支原體成分可能觸發或加劇CRS，導致難以控制的炎癥風暴。引起過敏反應等其他免疫副作用。
（3）導致治療失敗：受污染的細胞產品可能完全失效，患者不僅無法獲益，更可能錯過最佳治療時機。
3. 對生產過程的挑戰
（1）交叉污染：支原體極易在培養箱、操作臺、培養基等之間傳播，污染整個生產線。
（2）檢測耗時：法規要求的培養法檢測需28天，與細胞產品“現做現用”的緊迫時間窗口存在巨大矛盾。
監管與質量控制要求
鑒于其極端危害，全球監管機構（如FDA、EMA、NMPA）對支原體檢測有強制性和放行必檢的要求。傳統方法有培養法和指示細胞培養法，但是NAT法靈敏度，檢測效率更高，是發展趨勢[1-9]。
檢測標準：
（1）培養法：黃金標準，但耗時長達28天。
（2）指示細胞培養法（DNA熒光染色法）：常用替代方法，更快（約1周），靈敏度高，但操作繁瑣。
（3）核酸擴增技術（NAT）：最快（1天內），靈敏度極高，已成為各國藥典認可的重要方法（如qPCR法）。
在細胞治療產品的研發與生產過程中，病原體污染可能導致嚴重的臨床風險，而傳統檢測方法（如培養法）存在周期長、靈敏度不足等局限性。熒光定量PCR憑借其高靈敏度、快速和特異性強的優勢，成為細胞治療質量控制的關鍵技術。本試劑盒針對細胞治療產品的特色需求開發，可精準檢測多種病原體污染物，確保從細胞庫建立到終產品放行的全流程安全性，為細胞治療產品的合規化生產提供可靠保障。
二、產品目錄
三、實驗原理
TaqMan探針法是一種基于熒光定量PCR的檢測技術，通過特異性引物和熒光標記的探針與目標核酸結合，探針5’端標記有熒光報告基團(Reporter, R)，3’端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q)。探針完整時，R發射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光。在qPCR擴增過程中，Taq酶切割探針，使熒光報告基團與淬滅基團分離，產生熒光信號，其強度與目標核酸數量成正比，從而實現高特異性、高靈敏度的定量分析。
四、試劑盒優勢
超敏檢測：靈敏度達1-10拷貝/μL，可識別極微量污染風險。
精準鑒別：探針特異性識別靶序列，避免假陽性/假陰性。
全程監控：覆蓋從細胞建庫、培養監控到終產品放行全流程。
應用廣泛：適用細胞治療、生物制藥、科研等多個場景。
平臺兼容：兼顧不同廠家及型號qPCR儀。
合規可靠：嚴格符合ChP/EP/USP等藥典標準。
五、性能指標
符合《歐洲藥典》(EP 2.6.7)、《美國藥典》(USP 63)、《日本藥典》(JP 18)中對支原體的檢測要求。
1.靈敏度與檢測限
使用本產品靈敏度可達至少10 CFU/mL，檢出比例均達95%以上。
2.專屬性與特異性
可特異性檢測100多種支原體，與以下細菌、真菌、細胞基因組、培養基等無交叉反應，無CT值。
3.基質效應
在以下基質中加入支原體標準品，試劑盒檢測結果與性能不受影響。
4.凍融穩定性
試劑盒經反復凍融1-5次，檢測結果和性能不受影響。
5.重復性
試劑盒批內與批次間變異系數(CV)均小于10%，重復性好。
6.兼容性
使用不同品牌熒光定量PCR儀：ABI 7500、博日FQD-96A和BIO-RAD CFX96，檢測相同樣本，均可準確鑒定支原體陽性/陰性，ABI 7500靈敏度優于后兩者。
六、檢測結果（以支原體為例）
- 擴增曲線
2. 標準曲線
本系列產品基于Taqman探針法，實現目標病原體核酸的定性和定量檢測。適用于細胞治療、生物制藥、科研等領域，覆蓋從細胞建庫、培養監控到終產品放行的全流程，精準檢測微生物（細菌、真菌、支原體、病毒）污染，符合藥典標準及法規要求，為細胞治療產品的安全性提供可靠保障。
Reference：
[1]Images by Martina Maritan.
[2]H S Çetin et al. Response to doxycycline and oxytetracycline treatments in cats infected with Mycoplasma spp. and analysis of haemato-clinical findings and risk factors. Trop Biomed. 2021. 38(2):149-158.
[3]B. B. A. Raymond, et al. Mycoplasma hyopneumoniae resides intracellularly within porcine epithelial cells. Scientific Reports. 2018. 8:17697.
[4] 《中國藥典》，<3301>.
[5] USP <63> Mycoplasma Tests.
[6] European Pharmacopoeia 11th Edition，<2.6.7. Mycoplasmas>. Appendix: Nucleic acid amplification techniques.
[7] EMA Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.
[8] ICH Q5A(R1): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin.
[9]ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.