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Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀最少僅需170uL樣品體積即可得到細胞密度和活率結果。為了準確分析不同細胞，Vi-CELL BLU提供了創建和優化自定義Cell Type設置的功能。本文我們拿容易團聚的HEK293細胞給大家介紹下Cell Type的設置是如何影響樣品的處理和圖像分析。
在分析團聚細胞時，Cell Type設置中首先會使用到的參數是Decluster degree，我們可以設置為None，Low，Medium或High，并且使用更靠后的值會增加軟件對團聚細胞的識別能力。
當出現過多的團聚，我們還需要考慮增加對樣品的Aspiration和Mixing Cycles次數。在每次Aspiration過程中，細胞樣品會在樣品管和注射器之間來回吹打混懸。對于那些很難混懸分散或傾向于粘到樣品杯壁上的細胞樣品，建議使用這種方法。在Mixing Cycle過程中，臺盼藍和細胞樣品一起在樣品管和注射器之間來回混勻。增加Mixing Cycles次數會讓臺盼藍混勻地更好。Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀的設計降低了剪切力對細胞的傷害。另外，低剪切力可以提高結果的重現性。但增加Aspiration或Mixing Cycles會提高額外剪切力，從而對比較脆弱的細胞產生潛在的危害。但是，對于團聚細胞系，這些額外的剪切力則可以用于破壞細胞的團聚。
Decluster degree和Aspiration/Mixing Cycles之間重要的區別在于它們是在哪個時刻影響的分析結果。Decluster degree只對測試結束后保存在軟件上的細胞照片根據不同設置的Decuster degree重新進行分析。而Aspiration和Mixing Cycles是在拍照前對細胞樣品就產生了影響，測試結束后無法再修改Aspiration和Mixing Cycles數值，得到再分析的結果。
因此，優化Cell Type對于得到好的結果很重要，本文中對于團聚細胞分析，如何調整Cell Type提供了一些指導。
團聚的細胞懸液也是細胞培養條件欠佳的指標，包括但不限于過度消化、環境應激、過度生長和污染。細胞團聚限制了細胞對資源和可用增殖空間的獲取。這將阻礙細胞生長，降低通量，并影響下游分析結果，譬如像流式細胞儀分析方法需要單細胞溶液。此外，ISO 20391-1(4)中聲明，為了獲得最佳計數結果（與所使用的分析方法無關），需要單細胞懸浮液，并且需要正確的樣品制備流程。Vi-CELL BLU 細胞計數和活率分析儀用紅色框標記（非常）大的細胞團。由于對大細胞團進行計數容易出錯，因此這些大細胞團不會進行去團聚處理，并會自動從計數中排除。這些大細胞團的數量可以在結果文件的“Cluster Count”中找到，這是培養物中細胞團聚的良好指標。如果觀察到細胞團較多時，建議進一步優化培養條件或進行樣品處理。
方法
這些實驗中使用的是FreeStyle 293-F 細胞（Thermo Fisher，Cat.編號：R79007）。將 HEK 懸浮細胞在含有FreeStyle 293（30 mL）表達培養基的 50 mL Falcon 管中培養，每 3-4 天傳代培養一次，接種細胞密度為 0.2x106 個細胞/mL。它們在 37°C、250 rpm 和 5% CO2 濃度下孵育。
使用培養 4 天的細胞樣品進行初始測量，在Normal模式下使用Mammalian Cell Type重復測量 5 次。然后結果被導出（每 10 張圖像照片保存一張）并離線重新分析。為了重新分析，基于默認的Mammalian Cell Type創建了另外兩個Cell Type，但將去團聚度設置為Low和High。為了研究不同去團聚度設置的有效性，比較了這三種Cell Type總細胞密度和活細胞密度以及活率的結果。
之后，開始用 HEK 293-F 細胞進行新鮮培養，并在第 0、1、2、3 和 6 天取樣。然后，測試了其他采樣參數，因為所有日期的樣品都用默認的Mammalian Cell Type，以及將Aspiration和Mixing Cycles增加到10次的Cell Type。在所有采樣日，將細胞培養液用 5 mL 移液器混合 2 次，然后將 5 mL 細胞培養液轉移到 15 mL Facon管中。接著，用 1000 μL 移液器將樣品再混合 3 次，再將 3 x 500 μL 細胞樣品轉移到 Vi-CELL XR 細胞計數和活率分析儀樣品管中，以及將 6 x 200 μL 細胞樣品轉移到 Vi-CELL BLU 96 孔板中。Vi-CELL XR 細胞計數和活率分析儀上的樣品，使用圖 1 所示的Cell Type分析；在Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀上，兩種Cell Type交替進行。然后，將 2 x 10 μL 細胞樣品與臺盼藍 1:1 混合并轉移到一次性血球計數板中手動計數。
圖1：Vi-CELL XR上的分析設置，選擇的設置類似于Vi-CELL BLU上的設置
然后，在Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀上運行的樣品以High Decluster degree重新分析，在 Vi-CELL BLU 細胞計數和活率分析儀上共生成4種不同的細胞計數結果，以與 Vi-CELL XR細胞計數和活率分析儀的結果和手動計數結果進行比較。
表1. Vi-CELL BLU分析HEK 293-F的Cell Type，Mammalian Cell Type作為其他3個Cell Types的模板。
結果
在三個Decluster degree下（Low，Normal和High）得到的平均總細胞密度和活細胞密度（分別為 TCD 和 VCD）和活率進行了比較（圖2）。更高的去團聚度使得TCD 和 VCD 值均明顯增加（R2 > 0.98）。然而，使用較低或較高的Decluster degree時，細胞活率卻并不顯著增加或減少。
圖2：Vi-CELL BLU使用不同Decluster degree設置分析HEK 293-F的結果。平均總細胞和活細胞密度顯示在左軸上，平均活率顯示在右軸上。誤差線表示標準差。
表 2 中的圖像顯示了Decluster degree如何影響樣品分析，從而影響細胞濃度結果。所選圖像是圖2中其中一個測量樣品的圖像（部分），并且很好地表示了細胞樣品的狀態。如前所述，HEK 293 F細胞傾向于形成團聚體，而這些團聚體中的細胞可能難以計數準確。當 Decluster degree 設置為 low 時，某些團聚將不再被解聚，并且標有藍色圓圈，表示Vi-CELL軟件錯誤地將它們識別為單個顆粒，因為其尺寸較大，根據所選Cell Type參數未歸為一個細胞。通過更高的去團聚度，可以分析更多這些團聚細胞，從而產生單個團聚標記為Normal Decluster degree，所有團聚細胞均在High declustering下進行分析。更高的Decluster degree設置會導致識別出額外的細胞，可能導致人為地提高細胞密度，因為單個細胞可能（幾乎）分裂成兩個或多個顆粒。這些顆粒是被忽略還是算作活細胞或死細胞取決于其他Cell Type參數，例如大小、圓度和亮度。因此，優化Cell Type設置對于獲得準確的結果很重要。
表2. 不同Decluster degree設置的分析結果，隨著Declustering增加，更多的細胞團聚被分析，細胞團聚體中更多的細胞被識別。
請注意，Cluster count不受Decluster degree的影響。對于“Low”和“High”設置，每次測量平均計數 1.6 個Clusters。Cluster count指示在樣本中發現了多少個過大的細胞團聚體。這些Cluster用紅色框標記，并且無論Decluster degree如何，都完全排除在分析之外。因此，高的Cluster count是大細胞團聚體的良好指示，需要在培養處理或樣品制備方面進行額外優化，以獲得準確的細胞計數結果。
最終，在優化Cell Type設置時，Vi-CELL BLU 軟件還提供了增加Aspiration和Mixing cycles的可能性。增加Aspiration和Mixing的影響評估，是使用默認的Mammalian Cell Type，將其中的Aspiration和Mixing cycles都設為10，每天對 HEK 293-F 細胞樣品進行采樣，并一式三份測定細胞密度。之后，使用表1所述的High Decluster degree重新分析所有測量值。將結果與使用Vi-CELL XR細胞計數和活率分析儀及手動計數獲得的值進行比較（圖3）。
圖3: Vi-CELL BLU用4種不同Cell Types檢測的總細胞密度和活率（藍-灰色），Vi-CELL XR（紅色）和手動細胞計數（綠色）。誤差線表示標準差。
圖 3 顯示了 Vi-CELL XR細胞計數和活率分析儀、血球計數板、Vi-CELL BLU 細胞計數和活率分析儀（使用默認Mammalian Cell Type）測試6天得到的細胞密度和活率具有可比性。此外，Mixing增加和/或High declustering的Cell Type會導致更高的細胞密度。在第3天，測量的平均 TCD 介于 2.81 – 4.12 百萬個細胞/mL 之間，分別使用默認的 Mammalian 和 Mammalian A10M10 High decluster。因此，與默認設置相比，更改兩個參數后結果增加了 47%。
然而，在第6天存活率下降到~70%，而且手動計數的TCD明顯比自動細胞計數儀的TCD更高。表 3 中的圖像（通過顯微鏡顯示 Neubauer 分析室）為這種偏差提供了清晰地解釋，因為與第 3 天相比，第 6 天的細胞樣品中顯示有更多的細胞聚集體。這些細胞聚集體很難計數，在分析過程中將完全忽略大的團聚細胞。
表3: 第3和第6天HEK 293-F細胞計數顯微鏡下的照片。第6天可以看到更多的細胞團聚體，細胞活率降低。
專注于培養的前 3 天（圖 4）可以進一步研究不同的Cell Type設置如何影響計數結果。第 3 天血球計數板圖像（表 3）顯示，到目前為止，細胞主要以小聚集體或單細胞形式生長。仔細觀察Cluster count可以發現，Clusters的平均數量從第 1 天的 0.7 個增加到第 2 天的 3.7 個和第 3 天的 8.7 個。同時，更高的Mixing和Aspiration cycles的效果似乎有所增加，第 1 天的 TCD 增加了 4%，而第 2 天和第 3 天分別增加了 17% 和 25%。在Mammalian A10M10 High decluster設置下的結果一直是最高濃度。
圖4: HEK培養的前3天。在 Vi-CELL BLU 上以藍灰色以及 Vi-CELL XR（紅色）和手動計數（綠色）測定四種不同的細胞密度和活率。誤差線表示標準差。
總之，每日采樣結果進一步證明了正確Cell Type設置的重要性。僅改變三個參數就導致 TCD 增加 47%。測量團聚的HEK細胞時，調整Decluster degree和Mixing/Aspiration cycles可以得到更高的TCD。然而，第6天的數據（圖3）表明，應避免過度團聚的細胞樣品，因為與手動計數相比，所有Cell Type的結果都明顯較低。
討論
本文討論了使用 Vi-CELL BLU 細胞計數和活率分析儀優化細胞計數結果的幾種選擇。除了優化一般的培養處理 - 這將改善細胞健康、通量和產率 – 可以通過調整樣品處理和分析來改進。通過演示使用不同Cell Type設置的影響，可以清楚地看出針對所用細胞系和應用優化這些設置對于獲得好的分析結果至關重要。
在處理傾向于形成聚集體的細胞系時，對Decluster degree、Aspiration cycles和Mixing cycles的擬議更改是優化計數性能的良好起點。但是，當可能需要進一步優化時，請隨時向貝克曼庫爾特生命科學的相關技術人員尋求支持。
● 參考資料：
1. Cell Culture Problems: Cell Clumping – Causes, How to Unclump Cells & How to Avoid Cell Clumping. akadeum.com. [Online] Akadeum Life Sciences, February 2021. [Cited: 25 July 2023.] https://www.akadeum.com/blog/cell-clumping/.
2. Cell Clumping Troubleshooting. Sigma Aldrich. [Online] Merck KGaA. [Cited: 25 July 2023.] https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cellculture-analysis/mammalian-cell-culture/cell-clumping-troubleshooting.
3. Biomass and Aggregation Analysis of Human Embryonic Kidney 293 Suspension Cell Cultures by Particle Size Measurement. Yung-Shyeng Tsao, Russell G. G. Condon, Eugene J. Schaefer, David A. Lindsay, and Zhong Liu. s.l. : Biotechnology progress, 2000, Bd. 16(5). 809-814.
4. ISO 20391-1. Biotechnology — Cell counting — Part 1: General guidance on cell counting methods. s.l. : ISO/TC 276, Biotechnology, 2018-01. First edition. ISO 20391-1:2018(E). 5. Cluster Count Analysis and Sample Preparation Considerations for the Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer. Wu, Andrew. s.l. : Beckman Coulter Life Sciences, 2023. 2023-GBL-EN-101754.
5. Cluster Count Analysis and Sample Preparation Considerations for the Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer. Wu, Andrew. s.l. : Beckman Coulter Life Sciences, 2023. 2023-GBL-EN-101754.