基因編輯是一項革命性的技術，但其脫靶效應一直是科學家對CRISPR-Cas臨床應用的擔憂。基因編輯可能導致在脫靶位點發生小片段的插入缺失，還有可能在在靶位點發生意外的大片段刪除或染色體倒位、易位。染色體重排異位非傳統意義的脫靶，但是可造成染色體劇烈改變，引起嚴重的毒副反應。美國FDA對基因治療產品的指導原則《Human Gene Therapy Products IncorporatingHuman Genome Editing》里明確指出，臨床基因治療需要評估脫靶導致的染色體易位。
?圖1: FDA關于染色體重排的指導原則
在此，舒桐科技小編向大家介紹一種新的染色體重排檢測技術——Primer extension-mediated sequencing (PEM-seq) ,它可以全面、精確量化基因編輯的雙鏈斷裂（DSB）后DNA的修復結果。
PEM-seq的實驗設計非常巧妙，通過在DSB上游設計引物（稱為誘餌primer），捕獲下游與DSB位點DNA修復后連接的序列（稱為獵物序列）。與其他脫靶分析技術相比，PEM-seq的優勢在于它可以檢測到在靶位點的小片段和大片段的插入缺失（indel），以及由脫靶導致染色體易位。PEM-seq的詳細的實驗步驟如下圖2。
圖2 PEM-seq實驗原理。
首先，PEM-seq可以得到在靶indel的編輯效率，并且與公認的擴增子編輯分析軟件CRISPResso結果相關性達到0.99，如下圖3。
圖3 在靶位點小片段插入缺失分布和與CRISPResso對比。來源：Nucleic acids research?49.15 (2021): 8732-8742.
?其次，PEM-seq通過捕獲還可以得到大片段的插入（>=20bp）和刪除（>=100bp）信息，這是常規擴增子無法得到的。如下圖4、5。
圖4 在靶位點大片段插入分布。來源：Nucleic acids research?49.15 (2021): 8732-8742.
圖5 在靶位點大片段刪除分布。來源：Nucleic acids research?49.15 (2021): 8732-8742.
更進一步，如果捕獲到的獵物序列距離DSB位點>500kb，那么這些位點則是易位產生的，誘餌Primer捕獲到的基因組易位位點通過下面的Circos圖展示。通過篩選易位位點與sgRNA同源序列，即可得到脫靶位點。如圖6，SpCas9，在基因組易位位點中共發現了7個脫靶導致的易位，而AsCas12a沒有檢測到脫靶導致的易位。
圖6 誘餌Primer捕獲到的易位位點（外圈），以及脫靶易位位點（內圈為在靶和脫靶位點連線）。來源：Nature Communications?13.1 (2022): 5623.
?目前，PEM-seq已應用于描繪Cas12家族的編輯產物的特征，該技術實現了對基因編輯的全面、高精度定量的安全性評估，在分析基因編輯的大片段插入、刪除、易位展現了獨特的優勢。因此，PEM-seq有望成為基因編輯領域的標準化脫靶分析技術，并為新型基因編輯工具臨床應用提供前瞻性指導。
PEM-seq科研服務
舒桐科技跟蹤最新前沿進展，配合資深研發團隊現已推出PEM-seq實驗和分析服務，服務詳情可見舒桐科技官網。
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參考文獻：
1.Liu, Mengzhu, et al. "Global detection of DNA repair outcomes induced by CRISPR–Cas9."?Nucleic acids research?49.15 (2021): 8732-8742.
2. Xin, Changchang, et al. "Comprehensive assessment of miniature CRISPR-Cas12f nucleases for gene disruption."?Nature Communications?13.1 (2022): 5623.