在分子檢測領域，技術的革新與產品的優(yōu)化始終是推動行業(yè)發(fā)展的關鍵力量。早期國內凍干技術多用于制藥領域，分子診斷試劑凍干發(fā)展相對緩慢，PCR凍干試劑是指將PCR反應所需的各種組分（包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、dNTPs、MgCl2、緩沖液和引物等）進行凍干處理，制備成穩(wěn)定的粉末狀/凍干球制品。加水復溶后，即可直接進行PCR反應。與傳統(tǒng)的液態(tài)PCR試劑相比，凍干試劑穩(wěn)定性強，便攜性、易用性高且可適配自動化設備，大大拓展了PCR技術在病原體快速診斷、基因檢測、法醫(yī)鑒定等領域真實場景的應用范圍。
隨著政策鼓勵醫(yī)療資源下沉，持續(xù)推進基層衛(wèi)生工作，以及針對發(fā)展中國家和資源匱乏地區(qū)，尤其是廣闊海外市場的拓展，PCR凍干試劑的應用范圍也將進一步擴大，它的運輸穩(wěn)定性和成本優(yōu)勢將發(fā)揮更大的作用，為疾病防控和公共衛(wèi)生事業(yè)做出重要貢獻。
翌圣生物提供優(yōu)質可凍干原料—
讓核酸檢測更加高效、便捷、經濟
凍干原料的篩選不是單純去掉不可凍干物質，原料選擇環(huán)節(jié)需要針對每一個組份進行篩選或調試。翌圣生物Zyme Editor™酶改造平臺通過理性設計和定向進化獲取性能優(yōu)異的酶原料，再結合儲液優(yōu)化、反應buffer調試、凍干保護劑的篩選及組合測試、凍干參數的測定等，實現凍干產品性能不差于常規(guī)液體PCR試劑、凍干成品形態(tài)完整、儲存穩(wěn)定的RT-qPCR可凍干試劑。
凍干是通過冷凍干燥的方法將液體中的水分移除，是一個多步驟的過程。冷凍干燥主要包括預凍、退火、一次干燥和二次干燥等關鍵階段。精確調控每個步驟的條件及參數，對于確保酶制劑在凍干后的生物活性和穩(wěn)定性至關重要，這其中預凍階段的凍結溫度、一次干燥階段的崩解溫度和加熱速率和二次干燥階段的溫度和時間尤為重要。
表1. 凍干各個環(huán)節(jié)中的影響因素
|
凍干階段 |
預期目的 |
影響因素 |
常用參數及影響機制 |
|
預凍 |
凍結后有合理的結構，以利于水分的升華。 |
預凍速度 |
慢速凍結形成較大的冰晶，有凍結濃縮現象，大冰晶水分容易逸出，升華干燥速率快，但二次干燥時由于表面積較小，解析干燥速率較慢；而快速凍結形成的冰晶小，沒有凍結濃縮現象，防止了溶質濃度引起的蛋白活性損失，但小冰晶升華速率低，解析速度快。 |
|
預凍最低溫度 |
通常低于溶液共晶點溫度 10-20℃，以確保完全凍結，共熔點與蛋白質性質、保護劑的種類和濃度有關。 |
||
|
預凍時間 |
與機器的制冷性能、凍干容器的傳熱性能、溶液的裝瓶厚度等熱傳導效率因素相關。預凍需確保在抽真空前樣品應處于凍結狀態(tài)，否則抽真空會引起噴瓶。 |
||
|
退火 |
促進未完全結晶的成分重新結晶，提高干燥效率 |
退火溫度 |
將凍結溫度上升到共熔點以下，持續(xù)一段時間后再降低溫度到凍結溫度，退火溫度應高于配方的最大濃縮液的玻璃化轉變溫度，以促進再結晶的形成。 |
|
一次干燥 |
通過升華過程去除樣品中的自由水。 |
干燥溫度 |
應低于共熔點溫度，但又可接近，以提高干燥速率。溫度需精準控制，否則溫度過低，升華時間加長，升華速率低，溫度過高，產品融化，出現干細現象。 |
|
真空度 |
通常在 0.1-0.1 mbar 范圍內，以促進水蒸氣的逸出。 |
||
|
干燥時間 |
與樣品的性質、溶液分裝時厚度、機器的捕水效率有關。 |
||
|
二次干燥 |
去除樣品中的結合水，進一步降低水分含量。 |
干燥溫度 |
通常在 20-40℃之間，具體溫度取決于樣品的耐熱性。 |
|
真空度 |
通常在 0.1-0.5 mbar 范圍內。 |
||
|
干燥時間 |
根據樣品性質和水分含量確定，通常需要幾小時。 |
可凍干反應體系的調整
- Buffer中不可含有可揮發(fā)和易氧化成分。
- 需對鹽離子濃度進行調試：過高可能造成凍干形態(tài)差；過低可能影響擴增性能。
- 凍干可能造成pH值變化，影響擴增性能，可針對凍干保護劑進行甘氨酸等添加劑的梯度添加測試，既可以起到緩沖pH的作用又是比較好的填充物。
- 凍干原料體系中的保護劑含量，針對不同體積的凍干，保護劑的使用量要相應變化。
- 凍干對酶有一定損傷，可通過補酶量、增加底物dNTPs等進行凍干體系的最適條件測試。
- 凍干試劑溶解后，局部濃度極高，需要混勻，保證復溶試劑體系均勻。若擴散不均勻，反應效率就會降低，CT值延后。此外，試劑濃度局部過高還會影響熒光信號的激發(fā)與采集，導致背景熒光強度過高。
產品推薦
Hifair® Lyo-Ready I Multiplex One Step RT-qPCR Kit（UDG plus)（Cat#16645）
一種無甘油、即用型的分子診斷試劑，含有RT-qPCR反應所需的所有組分以及凍干保護劑，使用 UDG-dUTP 防污染體系，能有效防止擴增產物氣溶膠污染的風險。此外，提供參考凍干工藝、兼容多種凍干形式，既可作為常規(guī)液體PCR體系的開發(fā)原料，亦可作為凍干PCR體系的開發(fā)原料。
產品優(yōu)勢
- 凍干后依然保持酶活性完整，性能和液體試劑一樣；
- 采用基因改造的抗體法熱啟動 Taq 酶，靈敏度高，5 copies/T可穩(wěn)定檢出；
- 含引物探針的凍干球，在50℃熱加速33天，性能不受影響；
- 快速程序下性能不受影響，30min即可出結果；
- 引入了dUTP/UDG防污染系統(tǒng)，可有效防止氣溶膠污染。
01
凍干形態(tài)
圖2.原位凍干及凍干球圖片展示
結果：16645適用于原位凍干及凍干球凍干，原位凍干時凍干品處于管底部，且無塌陷；凍干球外觀潔白光滑有光澤，無明顯發(fā)黃、坍塌和收縮，且復溶迅速。
02
凍干前后性能比較
|
儀器 |
7500 |
液體體系（紅色曲線） |
25 μL總體系，其中模板5uL |
|
模板 |
轉錄RNA模板 |
模板濃度 |
105、104、103 copies/uL |
|
凍干體系（藍色曲線） |
20uL體系凍干（含引物探針），取1顆凍干球加20uL無酶水，5uL模板。 |
||
|
擴增程序 |
50°C 2 min；95°C 30 sec；40 cycles (95°C 5sec；60°C 10 sec) |
||
圖3. 16645液體試劑和其凍干球性能測試
結果：16645凍干后復溶的試劑性能依舊穩(wěn)定。
03
熱加速實驗后性能驗證
|
儀器 |
7500 |
體系 |
25 μL |
|
模板 |
轉錄RNA模板 |
模板濃度 |
105、104、103 copies/uL及1 copy/uL |
|
對照組 （紅色曲線） |
20uL體系凍干（含引物探針），立即取1顆凍干球加20uL無酶水，5uL模板。 |
||
|
實驗組 （藍色曲線） |
20uL體系凍干（含引物探針），凍干球于50℃放置30天，取1顆凍干球加20uL無酶水，5uL模板。 |
||
|
程序 |
50°C 2 min；95°C 30 sec；40 cycles (95°C 5sec；60°C 10 sec) |
||
圖4. 16645凍干球性能及穩(wěn)定性測試
結果：將含HPIV引物探針的16645體系按說明書上凍干工藝和條件進行凍干，凍干球在50℃條件下加熱30天，與同批次剛出箱凍干球相比，擴增曲線峰形、Ct值、低濃度檢出率（1copy/uL，20個重復，檢出率均為100%）均沒有差異，凍干球穩(wěn)定性好。
IVD RDC服務
翌圣生物深耕分子酶領域多年，除了一如既往提供高標準及穩(wěn)定的原料外，也基于IVD產業(yè)鏈展開思考，以期產業(yè)鏈上下游以更好的合作模式實現產品快速產出，讓IVD企業(yè)釋放更多產能服務于核心業(yè)務。因此，翌圣生物設立了IVD RDC（IVD Research Development Center），通過深度參與IVD客戶的研發(fā)與工藝反應體系的改進，提供更好的服務與解決方案，幫助客戶解決痛點問題，簡化IVD生產流程，加速產品的商業(yè)化。
相關產品推薦
|
產品類型 |
產品描述 |
產品名稱 |
貨號 |
|
qPCR |
可凍干預混液 |
Hieff Unicon® Lyo-Ready I TaqMan Multiplex qPCR Mix |
|
|
RT-qPCR |
可凍干預混液 |
Hifair® Lyo-Ready I Multiplex One Step RT-qPCR Kit（UDG plus) |
16645ES HOT |
|
Hifair® Lyo Multiplex One Step RT-qPCR Kit |
|||
|
Hieff Unicon® V Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR Kit (with MgCl2) |
|||
|
凍干保護劑 |
凍干保護劑V2 |
||
|
LAMP |
Bst酶 |
Lyophilized Bst Plus DNA Polymerase (60 U/μL，Glycerol-Free) |
|
|
可凍干預混液 |
RT-LAMP pH Sensitive Dye Chromogenic Version Freeze-Dryable Kit |
||
|
單酶原料 |
Taq酶 |
Hieff Unicon® Hotstart J-Taq DNA Polymerase, 6U/μL，Glycerol-free |
|
|
Hieff UNICON® HotStart E-Taq DNA Polymerase, Glycerol-free（5U/μL) |
|||
|
逆轉錄酶 |
Hifair UCF. ME® Advanced Reverse Transcriptase, Glycerol-free（200U/μL) |
||
|
第五代耐熱逆轉錄酶（無甘油版） |
|||
|
UDG酶 |
Uracil DNA Glycosylase (UDG), Heat-Labile (Glycerol-Free) |
||
|
RNase抑制劑 |
Murine RNase Inhibitor (200 U/μL, Glycerol-free) |