重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可以在37~42 ℃條件下，10~30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)待測(cè)靶標(biāo)的快速檢測(cè)。它具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)儀器依賴程度低且可整合多種檢測(cè)模式等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于體外診斷、動(dòng)物疫病、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。
目前常用的與RPA擴(kuò)增相結(jié)合的檢測(cè)方法有電泳法、熒光探針?lè)?、?cè)流層析試紙條（LF-RPA）、絮凝分析檢測(cè)法，其中熒光探針?lè)ㄒ虿僮骱?jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、無(wú)需開(kāi)蓋處理產(chǎn)物（減少氣溶膠污染）等優(yōu)勢(shì)，已發(fā)展為目前最常用的一種結(jié)合RPA擴(kuò)增的檢測(cè)手段。熒光探針?lè)≧PA主要在RPA擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，加入了Exonuclease III和exo熒光探針，在RPA擴(kuò)增過(guò)程中Exonuclease III會(huì)特異地切割熒光探針（THF位點(diǎn)），導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi)，熒光信號(hào)被檢測(cè)到，通過(guò)熒光收集的儀器來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)晒庵档淖兓?。翌圣特推出一款Exonuclease III（Cat#14525ES），為RPA擴(kuò)增技術(shù)的廣泛應(yīng)用助力。
翌圣Exonuclease III
翌圣Exonuclease III是一種無(wú)堿基序列依賴性的核酸外切酶，該酶作用于雙鏈DNA，從3’OH末端方向逐步切去單核苷酸。該酶能降解平滑末端、3’凹陷末端及有切口的DNA，但是不能降解3’-突出末端大于或等于四堿基的序列。此外，該酶也有RNase H、3’-磷酸酶、脫嘌呤/嘧啶（AP）位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶活性。
產(chǎn)品應(yīng)用
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RPA擴(kuò)增中熒光探針的降解，釋放熒光信號(hào)；
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分子信號(hào)放大技術(shù)中雙鏈DNA 3’平末端切割；
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單鏈特異性探針的制備；
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制備用于雙脫氧測(cè)序的單鏈底物；
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雙鏈DNA的非定向巢式缺失。
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性能展示
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無(wú)核酸內(nèi)切酶殘留
圖3.對(duì)翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）進(jìn)行核酸內(nèi)切酶殘留檢測(cè)，結(jié)果顯示測(cè)試組與對(duì)照組條帶無(wú)明顯差異，說(shuō)明翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）無(wú)核酸內(nèi)切酶殘留。
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應(yīng)用于RT-RPA反應(yīng)，對(duì)RNA病毒的檢測(cè)限低至10 copies/T
圖4.用翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）進(jìn)行RT-RPA反應(yīng)，擴(kuò)增RNA病毒，檢測(cè)限低至10 copies/T。
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應(yīng)用于單克隆實(shí)驗(yàn)，提高單克隆陽(yáng)性率
圖5.使用翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）在單克隆實(shí)驗(yàn)前處理PCR回收產(chǎn)物，用于酶切去除產(chǎn)物中的短片段，提高單克隆陽(yáng)性率。結(jié)果顯示翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）可顯著提高單克隆陽(yáng)性率，且效果優(yōu)于進(jìn)口品牌A*的Exonuclease III產(chǎn)品。
翌圣RPA相關(guān)產(chǎn)品推薦
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
產(chǎn)品作用 |
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Exonuclease III(100 U/μL) |
具有3’→5’外切酶活性，切斷熒光探針中淬滅基團(tuán)，釋放熒光 |
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Bsu DNA polymerase(Large fragment,5U/μL) |
結(jié)合引物與原始靶核酸序列互補(bǔ)合成新的DNA模板 |
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T4UvsXRecombinase(2μg/μL) |
具有配對(duì)和鏈轉(zhuǎn)移活性的重組酶 |
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T4UvsY protein(2μg/μL) |
重組酶輔助因子，刺激T4UvsX的單鏈DNA依賴性ATP酶活性并降低活性所需的T4UvsX臨界濃度 |
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T4 gene 32 protein(gp 32)T4噬菌體基因32編碼蛋白 |
參與DNA復(fù)制、修復(fù)、重組與解鏈后的單鏈DNA結(jié)合，防止自雜交 |
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Creatine Kinase(2μg/μL)肌酸激酶 |
刺激ATP和肌酸分解為磷酸肌酸 |
參考文獻(xiàn)：[1] 施奕,徐昌平,余蓓蓓,盧亦愚,梅玲玲.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展[J].病毒學(xué)報(bào), 2020,36(03):522-532.[2] JiaLi, JoanneMacdonald, Stetten F. Review: a comprehensive summary of a decade development of the recombinase polymerase amplification[J]. The Analyst, 144.