新冠病毒核酸檢測原理
作者:河北品科研生物科技有限公司
2022-06-30T10:41
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mportant; overflow-wrap: break-word !important;">假陰性,就是指被檢測者已經感染了新冠病毒,
但是卻沒有檢測出病毒核酸,即核酸檢測為陰性。出現假陰性的原因主要有以下三方面:第一,原始檢測標本中新冠病毒核酸含量過低,低于能被檢測到的下限。這與所采集樣本的類型和采集的時機等都有關系。
第二,如果新冠病毒核酸與探針結合的部位發生變異,可能影響檢測中探針的結合效率,導致熒光信號檢測不到。
第三,假陰性也和檢測技術的靈敏度有關。
假陽性,是指因為種種原因把不是陽性的人檢測出陽性的結果。
造成PCR假陽性問題的因素相對單一, 由于PCR的敏感性和效率特別高, 只要有少的擴增產物將標本或反應管污染即可出現假陽性, PCR儀器的性能差異和溫控不準等質量問題造成非特異性擴增也會導致假陽性現象。
如果樣本采集和PCR試劑配制及反應實驗過程中, 引物設計不合理, 選擇的擴增列序與非目的性擴增列序具有同源性, 檢測樣品出現交叉污染、PCR試劑污染或PCR擴增產物污染、氣溶膠污染以及實驗室中克隆質粒污染都會造成假陽性現象出現。
06
遺傳物質DNA與RNA
我們常說的遺傳物質,一般是指DNA,但對于病毒而言,RNA則是它的遺傳物質。
對于細胞結構來講,只要有DNA的地方,DNA具有支配作用。而此時的RNA,也受DNA指揮。比如,當我們的細胞需要合成蛋白質時,位于細胞核的某個DN**段就會打開,然后在酶的作用下,合成信使RNA(mRNA),信使RNA則回頭可以在核糖體處,合成肽鏈。在這個過程中,我們看到了遺傳信息由DNA到RNA的過程,我們稱其為遺傳信息轉錄,該過程簡稱轉錄。

而對于病毒而言,它們比較特殊,很多病毒都以RNA為自己的遺傳物質。這是因為它們侵入細胞之后,可以將自己的RNA釋放其中,最后轉錄出病毒DNA。因為該過程是由遺傳信息是由RNA到DNA的過程,所以稱為逆轉錄。
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核酸檢測其實是檢測受測者體內是否有新冠病毒的核酸(RNA)。每種病毒的核酸內部都含有核糖核苷酸,不同的病毒所含的核糖核苷酸數量和排列順序不同,使得每種病毒都具有特異性。新冠病毒的核酸也是獨特的,核酸檢測就是對新冠病毒的核酸進行特異性檢測。
01
新冠病毒核酸檢測一般流程
1.由醫護人員穿戴防護服,收集位于病人鼻咽部的液體。
2.在實驗室內對可能存在的病毒樣液進行滅活處理,并提取樣本的核酸(這里面病毒只占很小一部分)。
3.對該樣本核酸進行PCR技術擴增。
4.將可與病毒信息匹配的熒光染料或熒光探針放入其中。
5.通過熒光強度,再結合對照組情況,綜合判斷是否存在新冠病毒。
02
前提:確定新冠病毒特異性特征
專業人員將該病毒提取出來后對病毒RNA進行測序,在該病毒身上尋找可以用來鑒別其特異性的片段。

03
準備工作:采集受測者樣本
在進行核酸檢測之前,需要采集受測者的痰液、咽拭子、肺泡灌洗液、血液等樣本,對這些樣本進行檢測,就可以發現受測者的呼吸道感染了什么病菌。新冠病毒核酸檢測常用的是咽拭子樣本檢測,將樣本裂解提純,從中提取出可能存在的新冠病毒核酸,檢測的準備工作就做好了。

04
關鍵技術:熒光定量RT-PCR
新冠病毒直徑只有60-140納米,一般細胞的直徑在10-20微米,而頭發絲的直徑在60-90微米。如果將細胞比作可以容納萬人的足球場,而病毒則好比里面的某個小座位一般不起眼。要想在如此小的尺度上分離出病毒,首先就是非常困難的事情,更別提如何去識別新冠病毒與其他病毒的差別。目前人們所使用的新冠病毒核酸檢測技術,主要是一種叫做實時熒光 RT-PCR 的技術。

PCR技術:聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于放大擴增特定的DN**段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大,進行比對。同理,痕量的病毒感染,其核酸也可以被捕捉到。該技術由1983年美國Mullis首先提出設想,1985年由其發明了聚合酶鏈反應,即簡易DNA擴增法,意味著PCR技術的真正誕生。
實時熒光定量PCR技術:實時熒光定量PCR技術是PCR技術的拓展,所謂實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

熒光定量RT-PCR技術是熒光定量PCR技術與RT-PCR技術的結合。
在檢測過程中,先采用RT-PCR技術將新冠病毒的核酸(RNA)逆轉錄為對應的脫氧核糖核酸(DNA);再采用熒光定量PCR技術,將得到的DNA進行大量復制,同時,使用特異性探針對復制得到的DNA進行檢測,打上標記。如果存在新冠病毒核酸,儀器就可以檢測到熒光信號,而且,隨著DNA的不斷復制,熒光信號不斷增強,這樣就間接檢測到了新冠病毒的存在。

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