過去十年來，新陳代謝的綜合研究取得了長足的進(jìn)步。質(zhì)譜技術(shù)（MS）通過同時測量多種代謝物發(fā)揮了核心作用。通過穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)追蹤代謝物標(biāo)記，還可以揭示代謝途徑的活動。
2018年，普林斯頓大學(xué) Joshua D. Rabinowitz 課題組在國際頂級期刊《Cell》上發(fā)表了題為“Metabolomics and Isotope Tracing”的論文。在該文章中，研究人員描述了質(zhì)譜技術(shù)對代謝物測量的基本原理，包括樣品準(zhǔn)備、代謝組學(xué)分析和數(shù)據(jù)解釋。此外，通過成功實(shí)驗(yàn)的例子，強(qiáng)調(diào)了代謝組學(xué)和同位素示蹤在揭示生物學(xué)方面的方式。
背景
然而，通過代謝組學(xué)測量代謝物濃度只能說明一半的問題。同樣重要的是理解代謝途徑的活動，這可以用單位時間內(nèi)的物質(zhì)流量來量化，即代謝通量。濃度和通量并不總是可靠地一致。在代謝中，代謝物的積累不僅可能是由于產(chǎn)生增加，還可能是由于消耗減少。例如，當(dāng)從酵母中去除葡萄糖時，糖酵解流出急劇下降，導(dǎo)致較低的糖酵解中間產(chǎn)物的積累，盡管途徑流入減少。由于代謝物水平和通量提供了互補(bǔ)的信息，因此通過研究兩者可以更好地了解代謝。
與代謝物不同，通量不是可以在質(zhì)譜儀中測量的物理實(shí)體。然而，可以通過同位素示蹤來推斷通量。經(jīng)典的放射性示蹤劑研究為現(xiàn)代對新陳代謝的理解奠定了基礎(chǔ)。今天，類似的研究可以使用質(zhì)譜或核磁共振來廣泛而定量地追蹤非放射性穩(wěn)定同位素示蹤劑的命運(yùn)。為了在系統(tǒng)層面量化通量，需要使用計(jì)算模型將大量示蹤數(shù)據(jù)集成起來。但即使沒有這樣的計(jì)算，通過對同位素示蹤實(shí)驗(yàn)的直觀解釋仍然可以獲得有價值的生物學(xué)洞察力。此外，直觀解釋通常可以通過使用方程來量化關(guān)鍵通量或通量比來進(jìn)行補(bǔ)充。這樣的定向同位素示蹤方法與代謝組學(xué)一起在這里進(jìn)行介紹。一、代謝組
代謝物由一系列耦合的酶反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生和消耗，將輸入的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為可用的能量和生物質(zhì)。在穩(wěn)態(tài)下，每種代謝物的定量流入和流出必須平衡。代謝網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模因生物體而異，從大約500個到幾千個反應(yīng)和水溶性代謝物不等。這些代謝物的結(jié)構(gòu)在從細(xì)菌到人類的各個生物中基本相同。這反映了所有生物體都需要核苷酸、氨基酸和脂肪酸來合成DNA/RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的事實(shí)。幾乎所有生物都合成或消耗葡萄糖，而纖維素是地球上最豐富的生物高分子。因此，大約有100種高通量化合物始終是主要的代謝組分：氨基酸、核苷酸以及糖酵解、磷酸戊糖途徑（PPP）和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。
與代謝的有限核心相比，生物系統(tǒng)中的小分子的完整范圍是龐大的。它包括其他功能重要的代謝產(chǎn)物：酶的激活劑和抑制劑；大分子修飾的供體和調(diào)節(jié)體；信號分子，包括神經(jīng)遞質(zhì)和激素；物種間戰(zhàn)爭的介質(zhì)，如抗生素；以及結(jié)構(gòu)和能量儲存分子，如脂質(zhì)。由于脂質(zhì)非常豐富且其性質(zhì)與水溶性代謝物不同，脂質(zhì)的測量形成了自己的“組學(xué)”領(lǐng)域（脂質(zhì)組學(xué)）。除了內(nèi)源代謝物外，食物鏈中較高層次的生物體還包含其他物種制造的次生代謝產(chǎn)物。人體樣本通常還含有藥物、人工香料和其他外源物質(zhì)及其代謝副產(chǎn)物。
除了已知的代謝產(chǎn)物之外，對未知代謝組的研究引起了極大的興趣。盡管基因組測序可以揭示生物體中的所有基因和蛋白質(zhì)，但由于未知蛋白質(zhì)的催化潛力、酶的多功能性以及來自食物的代謝輸入的多樣性，代謝產(chǎn)物的完整集合仍然難以定義。觀察到基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)研究中大多數(shù)峰值仍未被鑒定，增加了對未知代謝組的興趣，盡管這些峰值中的許多是分析假象。然而，新的代謝產(chǎn)物和反應(yīng)肯定還有待發(fā)現(xiàn)。
二、代謝組學(xué)
代謝組學(xué)，無論是否涉及同位素示蹤，包括三個基本步驟：（1）樣品準(zhǔn)備，（2）代謝組測量，以及（3）數(shù)據(jù)分析。
(1)樣品制備
在代謝組學(xué)中取得成功始于選擇合適的實(shí)驗(yàn)。在這方面，希望讀者能受到下文描述的一些生物應(yīng)用以及下面表格的啟發(fā)，該表突顯了許多不同的同位素示蹤劑及其實(shí)用性。在本節(jié)中，專注于代謝組學(xué)研究中的基本設(shè)計(jì)問題，這些問題適用于許多應(yīng)用領(lǐng)域。
對營養(yǎng)環(huán)境的控制尤為重要。對于體內(nèi)研究，這意味著需要密切關(guān)注飲食、禁食和飲食組成。對于細(xì)胞培養(yǎng)研究，這意味著要特別注意培養(yǎng)基的選擇和培養(yǎng)基更換的時機(jī)。通常情況下，化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基通常優(yōu)于復(fù)雜的生物培養(yǎng)基，如溶源肉湯 (LB)。對于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)，使用市售的透析胎牛血清可以避免血清代謝物造成的混淆。
對于同位素示蹤研究，通常最好在引入示蹤劑時避免代謝擾動，即保持“代謝穩(wěn)態(tài)”。這可以通過將特定的養(yǎng)分從未標(biāo)記形式更改為標(biāo)記形式，切換到其他方面相同的培養(yǎng)基來實(shí)現(xiàn)。標(biāo)記的持續(xù)時間取決于感興趣的代謝途徑以及是追求動態(tài)數(shù)據(jù)還是穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)。在培養(yǎng)細(xì)胞中，通過大約10分鐘實(shí)現(xiàn)糖酵解的穩(wěn)態(tài)標(biāo)記（即“同位素穩(wěn)態(tài)”），而通過大約2小時實(shí)現(xiàn)三羧酸循環(huán)的穩(wěn)態(tài)標(biāo)記，核苷酸的標(biāo)記需要大約24小時。需要非常迅速的采樣來捕捉糖酵解標(biāo)記的動態(tài)過程（例如，10秒的時間尺度），而可以通過在15、30、60和120分鐘等時間點(diǎn)進(jìn)行采樣來探測三羧酸循環(huán)的動態(tài)過程。進(jìn)行為期一天的實(shí)驗(yàn)通常便于收集穩(wěn)態(tài)標(biāo)記數(shù)據(jù)。
另一個關(guān)鍵問題是收集代謝產(chǎn)物。對于細(xì)胞和組織來說，這是一個特殊的挑戰(zhàn)，因?yàn)樵S多重要的代謝產(chǎn)物在幾秒內(nèi)就會自然周轉(zhuǎn)。因此，獲得準(zhǔn)確的代謝物譜需要幾乎立即停止代謝活動。這仍然是一個積極研究的領(lǐng)域。典型的方法包括冷凍和/或酶變性。已經(jīng)報道了各種提取和滅活的方案。對于培養(yǎng)細(xì)胞，一個簡單的方法是在去除培養(yǎng)基后立即通過抽吸（對于附著細(xì)胞）或快速過濾（對于非附著細(xì)胞）添加冷有機(jī)溶劑。低溫會迅速減慢新陳代謝，有機(jī)溶劑會使酶永久變性。最好避免可能改變代謝的操縱，比如在滅活代謝之前沉淀或洗滌細(xì)胞。
對于組織標(biāo)本，最實(shí)際的方法是先冷凍，然后提取。通過在液氮溫度金屬板之間粉碎組織，可以實(shí)現(xiàn)快速冷凍，這一技術(shù)被稱為Wollenberger夾具。由于傳熱效果更好，這比直接將組織碎片放入液氮中要快得多。然后，可以將組織存儲在-80°C，通過研磨粉碎，然后用冷有機(jī)溶劑提取。在采樣之前和期間必須小心避免代謝的改變。這并不簡單，因?yàn)槁樽砘虬矘匪蓝伎赡芤鸫x變化。事實(shí)上，即使是實(shí)驗(yàn)者（或醫(yī)生）的視線也可能引發(fā)改變新陳代謝的壓力反應(yīng)。
另一個復(fù)雜因素是有機(jī)溶劑可能無法立即停止酶活性。持久的催化活性對于高能化合物如NADPH和ATP是一個特殊問題。這些豐富代謝產(chǎn)物的降解產(chǎn)物本身是生物學(xué)上重要的代謝產(chǎn)物，即使NADPH的輕微降解也會顯著增加NADP，而ATP的顯著降解也會增加ADP和AMP。對于對這些化合物感興趣的生物學(xué)家，建議使用有機(jī)溶劑和酸的組合進(jìn)行提取，因?yàn)樗峥梢约铀倜傅淖冃浴?/strong>具體而言，發(fā)現(xiàn)40:40:20乙腈：甲醇：水與0.1 M甲酸的混合物，然后在幾分鐘后加入碳酸氫鹽以中和樣品，能有效地捕獲這些代謝產(chǎn)物。未來可能會有更好的方法進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
代謝組學(xué)采樣的固有挑戰(zhàn)使得驗(yàn)證性測量變得尤為重要。例如，特定的基因擾動是否會在從麻醉和安樂死的小鼠的肝臟中采樣時產(chǎn)生相同的代謝變化？另外，某些代謝產(chǎn)物可以直接在體內(nèi)測量，例如使用熒光報告基因。與此同時，重要的是要認(rèn)識到即使是不完美的樣本收集也可能提供有價值的見解。在臨床研究中，組織采樣通常會發(fā)生一些延遲，但這是對人類數(shù)據(jù)益處的合理權(quán)衡。
（2）質(zhì)譜分析
拿到提取物后，面臨的挑戰(zhàn)是盡可能準(zhǔn)確地測量盡可能多的代謝物。在代謝組學(xué)的早期階段，常用一維質(zhì)子核磁共振（NMR）來生成代謝組圖譜。雖然峰可以被指定給功能團(tuán)，但大多數(shù)峰反映了來自多個代謝物的集成信號。通過多維NMR，這些局限性已經(jīng)得到部分解決，而且由于其結(jié)構(gòu)闡明、體內(nèi)代謝物測量和通用檢測的能力（幾乎每個代謝物都包含質(zhì)子，因此產(chǎn)生質(zhì)子NMR信號），NMR仍然在代謝組學(xué)中發(fā)揮著重要作用。然而，由于質(zhì)譜具有無與倫比的能力，可以檢測低豐度代謝物而不受與之相近物種的干擾，研究者們越來越多地依賴質(zhì)譜。
這反映了現(xiàn)代質(zhì)譜儀卓越的分辨率和靈敏度。在質(zhì)譜中，分辨率被定義為m/Δm的比率，其中m是分析物的質(zhì)量，Δm是可以區(qū)分的最小質(zhì)量差異。實(shí)現(xiàn)高分辨率允許獨(dú)立測量質(zhì)量差異較小的代謝物。例如，肌酸（C4H9N3O2）和亮氨酸（C6H13NO2），在正離子模式下的精確質(zhì)荷比分別為132.076和132.102，可以在4000分辨率下區(qū)分。對于同位素示蹤，高分辨率可以區(qū)分用不同重核標(biāo)記的物種。例如，帶有一個2H和一個13C的M+1棕櫚酸酯同位素異構(gòu)體可以在100,000質(zhì)荷比分辨率下分離。
要被質(zhì)譜檢測，液體提取物必須被電離。這通常是通過電噴霧電離實(shí)現(xiàn)的：在液體從針尖流出時施加高電壓，將液體轉(zhuǎn)化為最終生成氣相離子的微小帶電液滴。
電噴霧電離是一種相對“溫和”的電離過程，通常產(chǎn)生完整的（去）質(zhì)子化代謝物離子，在正離子模式下為（M+H）+，在負(fù)離子模式下為（M-H）−。然而，它還會生成多種加合物（例如[M+Na] +）和碎片，這使得所得的質(zhì)譜和下游數(shù)據(jù)分析變得復(fù)雜。
在代謝組學(xué)中常用的質(zhì)譜儀有飛行時間質(zhì)譜儀（TOF）、軌道阱和四極桿。這三者都在電場中操控離子。TOF儀器使離子在一根飛行管中競速。首先，通過電壓降（ΔV）加速離子以賦予其動能。然后，離子的速度取決于其質(zhì)荷比（m/z），質(zhì)荷比較低的離子在飛行管中飛行得更快。當(dāng)前的TOF儀器通常具有10,000至60,000的質(zhì)荷比分辨率。Orbitrap 儀器監(jiān)測紡錘形電極上下的離子振蕩。離子被注入軌道阱并繞主軸旋轉(zhuǎn)，靜電引力通過向心力平衡。由于紡錘體的形狀，離子也會沿著其長軸振蕩，這些 z 軸振蕩的頻率僅取決于離子 m/z。這些振蕩的頻率可用于確定 m/z，分辨率超過 100,000，甚至高達(dá) 1,000,000。盡管成本較高，但離子回旋共振儀器可以實(shí)現(xiàn)更高的分辨率，其中循環(huán)離子運(yùn)動是由強(qiáng)磁場引起的。
與TOF和orbitrap等高分辨率質(zhì)譜儀不同，四極桿充當(dāng)?shù)头直媛寿|(zhì)量過濾器，過濾掉除了特定感興趣的m/z以外的所有離子（±0.5 dalton）。四極桿通常放置在高分辨率質(zhì)譜儀的前面，以制成混合質(zhì)譜儀，如四極飛行時間（Q-TOF）。這使得能夠分離特定質(zhì)量的離子，然后進(jìn)行碎片化（通過與惰性氣體碰撞）并對碎片離子進(jìn)行高分辨率分析。由此產(chǎn)生的串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）譜反映了母離子的結(jié)構(gòu)，并可用于代謝物的鑒定?；蛘撸臉O桿可以在沒有高分辨率質(zhì)譜儀的情況下串聯(lián)放置，制成三重四極桿儀器。三重四極桿儀只測量預(yù)定義的目標(biāo)離子子集，但對于測量單一分析物提供了最佳靈敏度。
（3）色譜法
通過在質(zhì)譜測量之前在柱上物理分離分析物，色譜法增強(qiáng)了代謝組學(xué)的覆蓋范圍，并提高了質(zhì)譜的定量準(zhǔn)確性。色譜法尤為重要，因?yàn)殡妵婌F電離過程具有競爭性質(zhì)；豐富的離子會抑制共離子化物質(zhì)的信號。色譜分離減少了離子抑制，改善了對低豐度物種的檢測。它還可以防止定量偽影，其中豐度物種濃度的變化系統(tǒng)地改變了其他共離子化代謝物的信號強(qiáng)度。
色譜法的另一個優(yōu)點(diǎn)是異構(gòu)體的分離，異構(gòu)體是具有相同分子式但不同結(jié)構(gòu)的化合物，例如亮氨酸和異亮氨酸。異構(gòu)體在新陳代謝中很常見。例如，磷酸己糖有十多種異構(gòu)體，每種異構(gòu)體都有不同的生物學(xué)作用。通過簡單的 MS 無法區(qū)分異構(gòu)體，但可以通過色譜法和/或 MS/MS 碎片模式來區(qū)分。
色譜法對于區(qū)分真實(shí)代謝產(chǎn)物信號和在電離步驟中由于高電離能而導(dǎo)致的代謝產(chǎn)物碎裂引起的偽信號也至關(guān)重要，這時一些代謝產(chǎn)物可能分解成與其他代謝產(chǎn)物具有相同m/z的碎片。例如，檸檬酸的碎片模擬了四種不同的羧酸代謝產(chǎn)物。ATP的碎片模擬ADP和AMP。因此，盡管沒有色譜法的直接質(zhì)譜分析可以以高通量檢測大量離子，但它容易受到許多假陽性和假陰性的影響。
色譜法和質(zhì)譜通常被耦合在一起，例如氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）或液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）。氣相色譜要求分析物蒸發(fā)，并根據(jù)它們在氣相（“流動相”）和色譜柱內(nèi)的液層（“固定相”）之間的分配進(jìn)行分離。它最常與質(zhì)譜耦合，采用電子電離作為硬電離技術(shù)，產(chǎn)生一組特征性的碎片代替完整的代謝物離子。可以通過保留時間并將碎片模式與光譜庫進(jìn)行匹配來識別峰。相對于液相色譜，氣相色譜具有更優(yōu)越的色譜分辨率，尤其適用于測量低分子量（例如乙酸）、高揮發(fā)性（例如醇類）或電噴霧電離下離子化較差的分析物（例如甾醇）。通過化學(xué)衍生，它還可以測量中等大小的帶電代謝物，如糖單磷酸。
液相色譜通過在柱內(nèi)填充的溶劑和微米級珠子之間的分配對代謝物進(jìn)行分離。反相（RP）色譜法涉及疏水小珠（通常為C18）和使用從水到有機(jī)溶劑的梯度洗脫。它適用于許多極性代謝物和脂質(zhì)，但不能保留親水性代謝物，如氨基酸。對于含有多個磷酸基團(tuán)的代謝物，如ATP，它也產(chǎn)生較差的峰形。這些不足可以通過向運(yùn)行緩沖液中添加適度疏水的陽離子，如三乙胺，來進(jìn)行校正，它充當(dāng)離子配對劑，有助于將陰離子代謝物結(jié)合到色譜柱上。然而，陽離子配對劑在正模式下會導(dǎo)致嚴(yán)重的離子抑制，并且需要數(shù)周才能從LC系統(tǒng)中清除；因此，需要一個專用于負(fù)模式分析的系統(tǒng)。
親水相互作用色譜（HILIC）涉及親水性小珠，以及從有機(jī)溶劑到水的梯度洗脫。在過去的十年中，HILIC方法取得了顯著的進(jìn)展，允許在同一儀器上進(jìn)行正模式和負(fù)模式的分析。有多種HILIC柱的化學(xué)成分可供選擇。在這些中，發(fā)現(xiàn)酰胺樹脂對于測量核心代謝組特別有效。另一種適用于測量核心代謝組的液相分離方法是毛細(xì)管電泳，其中分離基于通過液體的差異電壓驅(qū)動而非柱上相互作用。
（4）數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)分析的第一步是將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成一個帶有峰標(biāo)識和樣本間強(qiáng)度的注釋表。這涉及到計(jì)算算法，用于選擇峰，使它們在樣本間對齊，并量化峰的強(qiáng)度。在典型的液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）運(yùn)行中，大多數(shù)>10,000個峰都反映了環(huán)境污染物、加合物或源內(nèi)碎片，而不是代謝物分子離子，可以忽略不計(jì)。有趣的峰可歸為兩類：（1）它們對應(yīng)于已知代謝產(chǎn)物；（2）它們在不同的生物條件下有顯著差異。
鑒于一種經(jīng)過良好注釋的色譜法，可以基于準(zhǔn)確的質(zhì)量和保留時間識別已知代謝產(chǎn)物。開源軟件Maven（現(xiàn)在維護(hù)為 ElMaven）專門設(shè)計(jì)用于提取已知代謝產(chǎn)物峰的強(qiáng)度和標(biāo)記模式。在具有準(zhǔn)確的色譜保留時間庫（使用代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)測量）的情況下，Maven或相關(guān)的商業(yè)軟件可以輕松查看原始離子特異色譜圖，并將這些原始數(shù)據(jù)流程化為已知代謝產(chǎn)物信號強(qiáng)度的表格。
為了找到不同生物條件下的峰，廣泛使用開源程序XCMS。它可以識別顯著變化并有助于搜索 MS/MS 譜圖匹配。XCMS 還可以通過基于網(wǎng)絡(luò)的平臺在線訪問。可以通過匹配已知標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和/或碎片模式來識別峰。通過MS/MS測量的碎裂圖譜在儀器之間相當(dāng)一致可以通過搜索 MS/MS 譜數(shù)據(jù)庫（例如 HMDB、METLIN）來識別代謝物。當(dāng)沒有找到MS/MS匹配時，MS/MS仍然可以提供關(guān)于未知化合物中存在的官能團(tuán)的線索。然而，對于小分子結(jié)構(gòu)的闡明，核磁共振（NMR）仍然是黃金標(biāo)準(zhǔn)。
（5）解釋
解釋代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的起點(diǎn)是理解信號強(qiáng)度和濃度之間的關(guān)系。在質(zhì)譜中，對于任何給定的分析物，信號強(qiáng)度（以離子計(jì)數(shù)測量）通常與濃度呈線性關(guān)系。因此，可以基于離子計(jì)數(shù)的倍增變化推斷相對量。然而，不同化合物的響應(yīng)因子（例如電離效率）差異很大。因此，絕對定量需要與標(biāo)準(zhǔn)品比較。最好的方法是在淬火時添加同位素內(nèi)標(biāo)。由于許多代謝物并沒有同位素標(biāo)準(zhǔn)品，因此有時標(biāo)記生物樣品更容易（例如，通過在[U-13C]葡萄糖中培養(yǎng)細(xì)胞）。一旦對參考條件的絕對代謝物水平有所了解，就可以通過相對定量確定其他條件中的絕對水平。以濃度為考量，而不是任意的信號強(qiáng)度，有助于將研究結(jié)果置于情境中。例如，當(dāng)在特定條件下代謝物上升時，它是否影響滲透壓？或者它仍然只存在微量？濃度如何與消耗酶的Km值相關(guān)？
可視化代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集中濃度變化的整體模式的一個好方法是使用聚類熱圖，可以使用免費(fèi)開源工具生成（例如Cluster 3.0和Java Treeview）。樣品中顯示相似模式的代謝物組合在一起，如樹狀圖（樹形圖）中所反映的那樣。
熱圖也可以用于將顯示相似代謝響應(yīng)的樣本分組在一起。評估樣本之間的整體相似性或差異的一種更精細(xì)的方法是主成分分析，它可以識別最能區(qū)分樣品的代謝物的線性組合。沿著前兩個主要成分繪制樣品的位置，以圖形方式突出顯示哪些樣品具有相似的代謝物特征。此類圖可以通過 MetaboAnalyst等免費(fèi)軟件生成。
數(shù)據(jù)分析的另一個方面是查找在不同條件下顯著變化的代謝物（或標(biāo)記模式）。這可以使用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)來完成。由于代謝組學(xué)研究測量許多代謝物，因此僅憑偶然性（平均為 100 中的 5），預(yù)計(jì)某些代謝物的 p 值將 < 0.05。為了降低錯誤發(fā)現(xiàn)率，應(yīng)使用 Benjamini-Hochberg 過程調(diào)整 p 值。錯誤發(fā)現(xiàn)糾正后的重要發(fā)現(xiàn)可以在條形圖中突出顯示。
對于同位素示蹤，可視化標(biāo)記模式的一種便捷方法是堆疊條形圖，其中每種顏色代表特定的標(biāo)記形式。在分析標(biāo)記數(shù)據(jù)之前，校正天然同位素豐度非常重要。最大的貢獻(xiàn)者是 1.1% 的天然碳 13 豐度，但最好校正所有相關(guān)的天然同位素，同時考慮到所使用的示蹤劑和質(zhì)譜儀的分辨率。為此目的而存在軟件。標(biāo)記分?jǐn)?shù)為標(biāo)記形式的絕對量值提供補(bǔ)充信息。
在查看了聚類熱圖并逐個檢查變化的代謝物后，數(shù)據(jù)中的關(guān)鍵信息通常開始浮現(xiàn)。為了促使這一過程，通常通過檢查其結(jié)構(gòu)、使用類似KEGG或MetaCyc的通路數(shù)據(jù)庫檢查其產(chǎn)生和消耗途徑，并通過Google或PubMed搜索已知的生物學(xué)關(guān)聯(lián)，來“了解”顯示出有趣濃度或標(biāo)記變化的不熟悉的代謝物。還開發(fā)了軟件，以幫助基于在特定實(shí)驗(yàn)中顯示出水平改變的通路代謝物的比例來識別受影響的通路。
三、生物應(yīng)用
在這里，重點(diǎn)介紹代謝組學(xué)和同位素示蹤可以闡明生物學(xué)的四種一般方式。 在每種情況下，都會討論選定的成功實(shí)驗(yàn)。目標(biāo)不是回顧代謝組學(xué)和同位素追蹤的貢獻(xiàn)，而是討論一小部分實(shí)驗(yàn)，以激發(fā)新用戶的興趣。
a、尋找特定的代謝物
代謝組學(xué)最強(qiáng)大的應(yīng)用之一是尋找具有特定生物學(xué)作用的代謝物。一個簡單的情況涉及識別酶的底物。對于新的或非特異的酶，生理底物在生物化學(xué)上可能難以識別。現(xiàn)在有許多成功利用代謝組學(xué)進(jìn)行這一目的的例子。典型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)涉及敲除酶并尋找代謝組的變化。在大多數(shù)情況下，酶敲除導(dǎo)致生理底物的積累，而 XCMS 等軟件可以有效地從非目標(biāo) MS 數(shù)據(jù)中提取這些峰。
代謝組學(xué)還可以識別意想不到的酶產(chǎn)物。一個特別重要的案例涉及導(dǎo)致人類癌癥的 TCA 循環(huán)酶異檸檬酸脫氫酶（IDH1 和 IDH2）的活性位點(diǎn)突變體。雖然最初的生物化學(xué)提示這些突變酶是無活性的，但代謝組學(xué)分析顯示，表達(dá)致癌突變 IDH 的細(xì)胞具有正常量的酶的典型底物和產(chǎn)物，但三個意外的 LC-MS 峰急劇增加。這三個峰都在單一保留時間點(diǎn)發(fā)生，表明它們都起源于單一代謝物。其中一個峰被證明是突變酶產(chǎn)生的代謝錯誤產(chǎn)物 2-羥基戊二酸的分子陰離子。另外另外兩種是鈉加合物和源內(nèi)脫水產(chǎn)物。隨后的研究表明，2-羥基戊二酸通過抑制組蛋白和 DNA 去甲基化而導(dǎo)致癌癥。
代謝組學(xué)還可以用于識別與更復(fù)雜生物學(xué)功能相關(guān)的代謝物。一種方法是從引發(fā)感興趣的生物反應(yīng)的提取物開始。可以使用大小過濾、有機(jī)萃取或熱處理來確定活性是否存在于小分子或大分子（例如蛋白質(zhì)）中。當(dāng)活性存在于小分子中時，代謝組學(xué)可以識別其中存在的物質(zhì)。然后可以將提取物純化成級分，尋找與生物活性一致的MS（或NMR）峰。這種方法成功地識別了氨基酸纈氨酸的代謝產(chǎn)物3-羥基異丁酸，作為跨血管內(nèi)皮細(xì)胞脂肪運(yùn)輸?shù)恼T導(dǎo)劑。
也許最大的興趣在于識別與常見人類疾病相關(guān)的代謝物，以用作診斷或預(yù)后標(biāo)志物。代謝物在發(fā)揮這種作用方面的潛力已經(jīng)得到充分驗(yàn)證，葡萄糖和膽固醇的測量在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中至關(guān)重要。重要的是，葡萄糖和膽固醇濃度的輕微變化（例如50%）被用于指導(dǎo)診斷和治療。為了通過代謝組學(xué)找到類似的生物標(biāo)志物，需要大樣本量。為了減少選擇峰和假發(fā)現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)機(jī)會，迄今為止，人類常見疾病最成功的代謝組學(xué)研究都集中在已知的代謝物上。例如，為了發(fā)現(xiàn)能夠預(yù)測2型糖尿病發(fā)展的代謝物，通過 LC-MS 對 Framingham 后代研究中跟蹤 12 年的 2,422 名個體樣本進(jìn)行了分析，重點(diǎn)使用三重四極桿 MS 分析核心代謝組。這揭示了支鏈氨基酸（BCAA：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）濃度的適度增加（30%）預(yù)測未來胰島素抵抗。由于在這種基于人群的人類研究中很難證明因果關(guān)系，因此在小鼠模型中尋找相同的表型是有價值的。事實(shí)上，在標(biāo)準(zhǔn)小鼠糖尿病模型中很早就發(fā)現(xiàn)了支鏈氨基酸升高。這些模型現(xiàn)在被用來確定支鏈氨基酸升高的機(jī)制以及這種升高如何影響發(fā)病機(jī)制。總的來說，這些研究強(qiáng)調(diào)了代謝組學(xué)在尋找具有特殊生物學(xué)重要性的代謝物方面的效用，包括癌癥和糖尿病這兩種最常見疾病的新驅(qū)動因素。
b、縱觀全局
除了發(fā)現(xiàn)特殊重要性的代謝物之外，代謝組學(xué)的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是全局視角。在許多情況下，通過看到多個相關(guān)代謝物同時變化來增加信心。顯著的例子包括糖尿病患者中所有三種支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）水平升高，以及自閉癥患者中三種不同的煙酰胺相關(guān)代謝物水平升高。同樣，雖然各種乙?；瘉喚贩N類先前已被認(rèn)為與癌癥有關(guān)，但在這些代謝物在多項(xiàng)代謝組學(xué)研究中成為最強(qiáng)的癌癥預(yù)測因子后，人們對這些代謝物作為生物標(biāo)志物的興趣大大增加。
除了將特定的代謝變化置于背景中之外，代謝組學(xué)還可以揭示一般的生物學(xué)原理。 例如，微生物的多項(xiàng)代謝組學(xué)研究支持這樣的概念：代謝對遺傳變化相對穩(wěn)健，但對營養(yǎng)環(huán)境敏感。在大腸桿菌和酵母中，酶的單次敲除對整體代謝組影響不大，主要是代謝物直接在被消除的酶上游積累。轉(zhuǎn)錄因子和信號蛋白的敲除突變體在代謝組中表現(xiàn)出更弱但更廣泛的變化，這些變化相對微妙，但反映了基因的功能。相反，營養(yǎng)環(huán)境的變化導(dǎo)致代謝物濃度的大規(guī)模全局變化。為什么中心代謝酶的敲除通常只產(chǎn)生局部代謝變化，而養(yǎng)分匱乏產(chǎn)生全局代謝變化？代謝網(wǎng)絡(luò)包含多個部分冗余的途徑，可以繞過許多堵塞。但元素營養(yǎng)素是無可替代的。更一般地說，由于底物可用性對通量的強(qiáng)烈影響，代謝與營養(yǎng)環(huán)境密切相關(guān)。對養(yǎng)分限制的強(qiáng)烈代謝物變化可能具有多種好處：提供養(yǎng)分條件的穩(wěn)健胞內(nèi)信號；在艱難的養(yǎng)分環(huán)境中優(yōu)化生存和生長；并在養(yǎng)分條件改善時為細(xì)胞迅速恢復(fù)做好準(zhǔn)備
代謝組學(xué)還可以與其他組學(xué)方法相結(jié)合。這些努力的一個重要目標(biāo)是了解不同生物分子類別的調(diào)控相互作用。這通常通過動態(tài)測量來促進(jìn)。例如，對擬南芥植物對光/暗循環(huán)的反應(yīng)進(jìn)行的一系列代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)測量發(fā)現(xiàn)，黑暗會快速誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解基因。隨后氨基酸水平增加。氨基酸水平的增加反過來觸發(fā)氨基酸生物合成基因的下調(diào)。這種“組學(xué)驅(qū)動的假設(shè)”的產(chǎn)生是有價值的，最終的證據(jù)在于檢驗(yàn)因果關(guān)系的驗(yàn)證性基因?qū)嶒?yàn)。
c、追蹤代謝路徑
代謝組學(xué)測量代謝產(chǎn)物的豐度。雖然提供信息，但代謝物豐度并不能揭示途徑活性：代謝物水平由生產(chǎn)和消耗的平衡以非線性方式?jīng)Q定。代謝水平增加可能是由于生產(chǎn)速度加快或消耗速度減慢所致。區(qū)分這兩種選擇通常是至關(guān)重要的。例如，當(dāng)代謝產(chǎn)物在疾病狀態(tài)下的產(chǎn)生增強(qiáng)時，抑制該途徑是合理的。因此，使用同位素示蹤探測途徑通量具有很大的價值。
這可以通過引入同位素示蹤劑并測量下游代謝物標(biāo)記的動態(tài)來實(shí)現(xiàn)。直觀地說，更快的標(biāo)記意味著更高的通量。實(shí)際上，對于直接由示蹤劑制成的代謝產(chǎn)物，標(biāo)記累積的初始速率（以摩爾濃度或每個細(xì)胞的摩爾數(shù)來測量，而不是標(biāo)記分?jǐn)?shù)）等于反應(yīng)的通量。對于此類代謝物，假設(shè)代謝穩(wěn)態(tài)，通量也可以根據(jù)標(biāo)記半衰期和代謝產(chǎn)物池的大小計(jì)算：通量 = ln 2 × 池大小 / t1/2。然而，對于更下游的代謝產(chǎn)物，標(biāo)記動態(tài)取決于示蹤劑和測量分析物之間所有代謝物的通量和池大小。例如，糖酵解和PPP通常以相似的速率標(biāo)記，反映了葡萄糖-6-磷酸的標(biāo)記，盡管糖酵解具有更高的通量。
另一種方法涉及確定同位素穩(wěn)態(tài)下的標(biāo)記模式。這樣的實(shí)驗(yàn)有利于避免在許多不同時間點(diǎn)進(jìn)行測量的需要。例如，為了評估相對于糖酵解的PPP通量，使用位置標(biāo)記葡萄糖的穩(wěn)態(tài)標(biāo)記比使用 [U-13C]-葡萄糖的動態(tài)標(biāo)記更有效。一種有效的示蹤劑是選擇性在碳1和2上標(biāo)記的葡萄糖（[1,2-13C]葡萄糖）。該示蹤劑通過氧化 PPP（而非糖酵解）進(jìn)行分解代謝，可產(chǎn)生 M+1 標(biāo)記的糖酵解代謝物。由于自然同位素M+1信號相當(dāng)大，因此對自然同位素豐度進(jìn)行正確校正至關(guān)重要。此外，將標(biāo)記模式與途徑活動精確關(guān)聯(lián)非常重要。例如，[1,2-13C]葡萄糖特異性地探測氧化性 PPP 產(chǎn)生的 5-磷酸核糖通過非氧化性 PPP 回到糖酵解的通量。如果核糖用于核苷酸合成（如增殖細(xì)胞中發(fā)生的那樣），則糖酵解中不存在 M+1 特征。下表提供了用于解釋生成的標(biāo)記模式的跟蹤器和啟發(fā)式列表。它包括簡單且廣泛使用的方法，例如均勻添加 13C 標(biāo)記的營養(yǎng)物質(zhì)并確定它們對 TCA 中間體的相對貢獻(xiàn)，以及使用位置標(biāo)記示蹤劑探測特定通量的巧妙方法。隨著通量分析領(lǐng)域的成熟，希望這種啟發(fā)式方法將得到越來越好的驗(yàn)證和廣泛使用。
目前，仔細(xì)思考代謝途徑中涉及的原子轉(zhuǎn)化以及它們與觀察到的同位素標(biāo)記模式的關(guān)系仍然非常有價值。這種分析可以識別具有生物學(xué)意義的意外通量。一個重要的例子涉及在喂食[U-13C]谷氨酰胺的哺乳動物細(xì)胞中對檸檬酸鹽進(jìn)行M+5標(biāo)記。谷氨酰胺代謝的標(biāo)準(zhǔn)代謝途徑涉及其轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，隨后在TCA循環(huán)中進(jìn)行α-酮戊二酸的氧化代謝，產(chǎn)生M+4檸檬酸。相反，α-酮戊二酸的還原羧化產(chǎn)生 M+5 檸檬酸。通過使用選擇性在其第一個碳上標(biāo)記的谷氨酰胺（[1-13C] 谷氨酰胺）進(jìn)行追蹤，并最終通過 IDH1 敲除后顯示 M+5 檸檬酸鹽的損失得到了嚴(yán)格證明。隨著這些努力更完整地繪制新陳代謝的功能能力，同位素示蹤將變得更加適用于更廣泛的生物學(xué)社區(qū)。
d、多細(xì)胞生物的示蹤
在通量分析中，最前沿的是追蹤活體動物。從生物化學(xué)的一開始，同位素示蹤劑就被用于植物和動物——但現(xiàn)在借助代謝組學(xué)的力量，此類研究正在被重新審視。與細(xì)胞培養(yǎng)研究或孤立微生物研究相比，解釋更為復(fù)雜，因?yàn)槿魏谓o定組織中的標(biāo)記不僅反映了其組成細(xì)胞的平均標(biāo)記，還反映了示蹤劑的藥代動力學(xué)，即示蹤劑及其代謝產(chǎn)物的循環(huán)水平。
為了應(yīng)對這種復(fù)雜性，一些相對簡單的計(jì)算是有價值的。對于動物研究，一個關(guān)鍵變量是同位素示蹤劑輸注速率。可以根據(jù)對循環(huán)營養(yǎng)物的內(nèi)源產(chǎn)生和消耗速率的了解來確定實(shí)現(xiàn)特定目標(biāo)富集在循環(huán)中所需的示蹤劑輸注速率，在穩(wěn)定狀態(tài)下，這些速率必須平衡并被稱為營養(yǎng)素的循環(huán)周轉(zhuǎn)通量：Fcirc = R(1 – L)/L，其中R是輸注速率，L是血漿代謝產(chǎn)物的標(biāo)記。通常最好實(shí)現(xiàn)在10%–30%的富集范圍內(nèi)，以盡量減小對循環(huán)代謝產(chǎn)物水平的干擾，同時有足夠的示蹤劑以觀察下游產(chǎn)物的標(biāo)記。
另一個有用的測量是血液中循環(huán)營養(yǎng)物對下游組織代謝產(chǎn)物水平的分?jǐn)?shù)貢獻(xiàn)。例如，谷氨酰胺對TCA循環(huán)的貢獻(xiàn)有多大？這可以通過注入標(biāo)記的谷氨酰胺直到組織標(biāo)記達(dá)到穩(wěn)態(tài)來探究。要估計(jì)谷氨酰胺的TCA貢獻(xiàn)，最簡單的方法是將組織TCA中間產(chǎn)物的標(biāo)記除以血清谷氨酰胺的標(biāo)記。當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)主要在組織內(nèi)分解代謝時，這種方法效果很好。對于谷氨酰胺而言，盡管在培養(yǎng)的癌細(xì)胞中它對TCA循環(huán)的貢獻(xiàn)最大，但在體內(nèi)的腫瘤中，它是次要的貢獻(xiàn)者。當(dāng)輸入的營養(yǎng)物也可以通過轉(zhuǎn)化為另一種循環(huán)代謝產(chǎn)物間接供給組織時，就需要采用更復(fù)雜的方法。為了確定不同營養(yǎng)物的直接貢獻(xiàn)，需要對所有感興趣的循環(huán)營養(yǎng)物進(jìn)行示蹤實(shí)驗(yàn)（例如，葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺）。通過了解每個示蹤劑對每種循環(huán)營養(yǎng)物的標(biāo)記以及組織標(biāo)記數(shù)據(jù)，然后可以通過簡單的矩陣計(jì)算確定每種營養(yǎng)物的直接貢獻(xiàn)。使用這種方法，發(fā)現(xiàn)從輸入的葡萄糖中的TCA標(biāo)記主要通過循環(huán)的乳酸進(jìn)行：某些細(xì)胞將葡萄糖分解為乳酸，將其分泌到循環(huán)中，并用作大多數(shù)組織甚至腫瘤的主要TCA底物。通過這種方式，糖酵解和TCA循環(huán)在各個組織中解耦，實(shí)現(xiàn)了它們的獨(dú)立組織特異性調(diào)節(jié)。因此，動物中的示蹤可以揭示生物體代謝的新設(shè)計(jì)原則。
四、未來發(fā)展方向
代謝組學(xué)的一個重要方向是分析程序的標(biāo)準(zhǔn)化。 這解決了幾個需求。首先，雖然分析的各個步驟并不是特別復(fù)雜，但構(gòu)建有效的集成工作流程仍然很棘手。其次，需要色譜標(biāo)準(zhǔn)化，以實(shí)現(xiàn)跨實(shí)驗(yàn)室的峰身份有效共享。經(jīng)過嚴(yán)格審查的精確質(zhì)量和保留時間的文庫最終應(yīng)該能夠?qū)崿F(xiàn)已知代謝物的自動定量。標(biāo)準(zhǔn)化程序還應(yīng)包括將帶注釋的數(shù)據(jù)表（包括測量的質(zhì)量、保留時間和單個樣品峰值強(qiáng)度）發(fā)布到公共存儲庫。隨著儀器的不斷改進(jìn)、實(shí)驗(yàn)方案的標(biāo)準(zhǔn)化以及數(shù)據(jù)分析和共享的自動化，代謝組學(xué)有望在未來十年內(nèi)為生物學(xué)家提供越來越廣泛的應(yīng)用和幫助。
前沿方向是什么？一個迫切的需求是更好地理解代謝物的范圍。許多實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在常規(guī)測量的約200種水溶性代謝物與LC-MS運(yùn)行中發(fā)現(xiàn)的約10,000個峰之間存在巨大的差距。這種差距的大部分是由于個別代謝物產(chǎn)生許多不同的離子，這是由于成分形成和源內(nèi)碎裂導(dǎo)致的。然而，在考慮了這些現(xiàn)象之后，未知的代謝物可能仍然多于已識別的代謝物。
Products of Interest
Catalog No. Description
CLM-420
D-Glucose (1-13C, 98-99%)
CLM-746
D-Glucose (2-13C, 99%)
CLM-504
D-Glucose (1,2-13C2, 99%)
CLM-2717
D-Glucose (1-13C, 99%; 6-13C, 97%+)
CLM-6750
D-Glucose (3,4-13C2, 99%)
CLM-4673
D-Glucose (1,2,3-13C3, 99%)
CLM-1396
D-Glucose (13C6, 99%)
DLM-349
D-Glucose (6,6-D2, 99%)
DLM-2062
D-Glucose (1,2,3,4,5,6,6-D7, 97-98%)
CDLM-3813
D-Glucose (13C6, 99%; 1,2,3,4,5,6,6-D7, 97-98%)
CLM-1579
Sodium L-lactate (13C3, 98%) 20% w/w in H2O
CLM-1578
Sodium L-lactate (3-13C3, 98%) 20% w/w in H2O
CLM-3612
L-Glutamine (1-13C, 99%)
CLM-1822-H
L-Glutamine (13C5, 99%)
NLM-1016
L-Glutamine (α- 15N, 98%)
NLM-557
L-Glutamine (amide-15N, 98%+)
NLM-1328
L-Glutamine (15N2, 98%)
CNLM-1275-H
L-Glutamine (13C5, 99%; 15N2, 99%)