免疫細胞

免疫細胞包括很多細胞：

先天免疫細胞：粒細胞（嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞），肥大細胞，單核細胞（發展成巨噬細胞），中性粒細胞，樹突狀細胞（DC是一種重要的抗原呈遞細胞（APC），也可以由單核細胞發育而來），自然殺傷細胞(NK具有先天免疫和適應性免疫的雙重特性，可以保留為記憶細胞）。

適應性免疫細胞：B細胞（有兩個主要功能: ① 向T細胞提供抗原，② 產生抗體來中和感染性微生物。）T細胞（有多種作用，并按亞群分類。T細胞分為兩大類: CD8+ T細胞或CD4+ T細胞）。

免疫細胞的收集

免疫細胞的收集通常說的是外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）的收集。正如名字所指出的，PBMC是指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞（Lymphocytes）、單核細胞（Monocytes）、樹突狀細胞（DC）和其他少量細胞。

淋巴細胞包括B細胞、T細胞、NK細胞等細胞，占據PBMC細胞的大多數，也并沒有發現很多將兩者分開的文章和操作手冊，因此在此我們只針對PBMC細胞的收集做一個概述。

PBMC存在于外周血中，可利用細胞分離技術從全血中分離出來。總的來說，PBMC只占全血樣本的一小部分（約1%），當被其他物質擠在一起時，很難進行研究。三種最常見的PBMC分離方法包括：密度梯度離心、熒光活化細胞分選（FACS）、磁激活細胞分選(MACS)，每一種血液分離方法都有自己的優點和缺點。

密度梯度離心

密度梯度離心依靠物理特性，如大小和密度來分選細胞群。通過將樣品放入高速旋轉的離心機中，不同類型的細胞將通過與相似密度的顆粒分組來進行分類。密度較大的粒子會落到底部或外面，而密度較小的粒子會停留在中心或上升到頂部。對一個標準的全血樣本進行離心，將分離出血液成分的一般層，集中在試管底部的紅細胞(大約占總體積的45%)，中間層的灰白色涂層層——包含各種白細胞和血小板(大約占總體積的1%)，以及血漿——包含允許血液流動的水狀液體，隨著各種蛋白質和溶解的營養物質和氣體(大約占總體積的55%)在管的頂部。

根據所用采血管含有的成分，密度梯度離心也有三種方法。

• 檸檬酸鈉CPT管采血的細胞分離

檸檬酸鈉是一種抗凝劑：檸檬酸根可與血液中的鈣離子結合，生成可溶解性的絡合物。由于鈣離子在凝血過程中起到促進凝血作用，因此血液中的鈣離子濃度下降會阻止血液的凝結。

步驟：

1. 室溫(15℃~ 30℃)豎直存放血漿收集管，直到離心。

2.?離心前將試管輕輕倒轉8 - 10次，使細胞重新混合。

3.?將離心管置于水平轉子中，室溫(15℃~30℃)，1800 x g (RCF)離心30分鐘。轉速必須仔細計算。降速過程中不要使用剎車。應注意確保CPT管是正確地安裝在離心機中。

4.?在離心機完全停止后，小心地取出試管并放置在一個架子上。

5.?單個核細胞和血小板位于血漿層下方的白色層中(見圖1)。

6.?在不干擾細胞層的情況下，從每根CPT管中抽取血漿層。如果方案要求收集血漿，請參閱方案的具體文件。

7.?用移液管從每個試管中收集單個核細胞層，并將其轉移到50mL帶帽的塑料錐形離心管。

8.?如果收集3根或更少(≤3根)CPT管，將全部CPT管收集到的細胞層放入一個50mL離心管。

9.?如果收集的CPT管多于3根(>3)，則取其中2 - 3根CPT管的細胞層放入一個50mL離心管。不要將三個以上CPT管的細胞層組合在一起放入一個50mL離心管。重復此步驟，直到將所有CPT管的細胞層轉移到50mL離心管中，然后進行洗滌步驟。

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圖1 CPT管離心結果

• 帶有預填充 Frit 屏障的ACD、NaHep或EDTA管采集血液的細胞分離

在加入血液之前，目視檢查CSTFB，看是否有液體在?Frit上面。如果?Frit上面有液體，將CSTFB在1000 x g下離心30秒。如果有密度梯度離心后溶液仍在?Frit上方，應吸除。

步驟：

1.?血液稀釋用于CSTFB分離

血液與生理鹽水的最大比例約為2:1。每10 ~ 20mL全血使用一個50mL管(或每5 ~ 10mL全血用一個12 ~ 14mL管)。按要求使用盡可能多的CSTFB來分配每個樣品的所有血液。

(1)?在每個CSTFB上標上樣品識別號。

(2)?用無菌吸管向每個CSTFB中加入生理鹽水溶液：50mL CSTFB管加5mL生理鹽水。

(3)?輕輕混合全血，然后用無菌移液器將血液轉移到標記的CSTFB中。

(4)?使用無菌移液器，用生理鹽水沖洗每個原始抗凝血管并轉移溶液沖洗量到CSTFB，確保不超過總管體積(生理鹽水+全血)的限制：50mL管的總體積不應超過30mL。

(5)?小心蓋上CSTFB。

2. CSTFB密度離心和PBMC收集

(1)?保持試管直立，輕輕轉移到離心機上。

(2)?800 ~ 1000 x g, 15℃~ 30℃離心15分鐘，關閉剎車。( 一些樣品在1000g離心PBMC分離的效果可以改善。如果降速過程中存在剎車，就會破壞分層。)

(3)?離心時，準備新無菌離心管；這將與上一步中使用的管子數量相同。用樣品識別號標記每個試管。

(4)?輕輕將CSTFB從離心機中取出，以免擾亂各層。

(5)?離心使試管（包括?Frit層）的內容物分成六個不同的層。

(6)?檢查管里是否有以下可能的問題。根據實驗室要求記錄觀察結果和采取的后續行動。

①、血漿+生理鹽水溶液層。

②、離心后在?Frit上可見凝塊。

③、 由于離心速度，時間或制動錯誤，PBMC層較差。PBMC層小而模糊，血漿+生理鹽水層可能略有混濁。

④、 由于紅細胞計數或紅細胞比容低，在?Frit上形成PBMC層。

(7)?每個樣品使用新的無菌移液管去除上層淡黃色血漿+鹽水溶液的組分，至云狀白色PBMC帶（位于血漿+鹽溶液層界面和透明分離介質溶液間）的上方約1~2厘米的位置。根據實驗室政策，丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。（ 或者，上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色PBMC帶可通過上層小心插入移液器移至PBMC帶。）

(8)?使用無菌血清學移液器收集上述PBMC帶處的所有細胞。注意不要吸入多于必要的分離介質溶液。

(9)?將收集到的細胞從一個CSTFB轉移到一個相應的、預標記的無菌離心管。管子可以預先添加鹽水溶液以節省時間（50mL管加25mL生理鹽水溶液）。之后進行洗滌步驟。

(10)?將含有剩余的紅細胞和分離介質CSTFB重新蓋上蓋子。按照實驗室政策，將CSTFB作為生物危害廢物丟棄。

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圖2 pre-filled Frit Barrier管離心結果

• 手動密度梯度介質覆蓋或襯底分離細胞?（Ficoll分離）

分離單核細胞常使用Ficoll作為分離液的主要成分，Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400000，當密度為1.2g/ml時也未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。

通過Ficoll密度梯度離心，紅細胞、粒細胞比重大于分離液比重，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分離液，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分離液中。吸取分離液液面上的細胞，就可從外周血中分離到單核細胞，并進行之后的培養與檢測。

步驟：

1.?血液稀釋

(1)?打開抗凝血管的蓋子。

(2)?在每根離心管上標上樣品識別號（50mL管加12 ~ 22mL血，15mL管加4至5mL血）。

(3)?將血液移入無菌、有標記的15或50mL離心管中，根據制備密度梯度的試劑盒說明加入足夠的生理鹽水來稀釋血液（血液與稀釋液的最大比例應為2:1）。

2.?密度梯度細胞分離

（兩種方法：（1）覆蓋overlay，先制備梯度在加樣品；（2）襯底underlay，先加樣品再加梯度。加完后蓋好蓋子。）

3.?淋巴細胞密度離心和PBMC收集

(1)?保持試管直立，輕輕地轉移到離心機。

(2)?按照說明書概述，在15~30°C條件下，400 x g離心30分鐘，關閉制動器。（ 如果降速過程中存在制動會破壞分離層。離心機制動器必須關閉以使分離干凈，并最大限度地回收pbmc。）

(3)?離心使管內內容物分成四層。

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圖3 ficoll密度梯度離心結果

(4)?在離心管進行離心時，準備新的無菌離心管。這將與上一步驟中使用的管子數量相同。用樣品識別號標記每個試管。

(5)?離心完成后從離心機上取下離心管。

(6)?如果看不到細胞層，確認離心機運轉正常。糾正你發現的任何問題。重新離心試管。記錄問題和在研究記錄中采取的行動。

①、如果再離心后細胞層仍然不可見，記錄，移除和丟棄鹽溶液上清，然后繼續。

②、如果血漿層非常渾濁，可能很難看到血漿層與密度梯度介質的界面。用10mL移液管除去界面上方的大部分血漿可改善淋巴細胞的收集，例如只留下0.5厘米的血漿層。為了收集細胞要求更好地定位移液器的尖端。

(7)?每份樣品使用新的無菌移液器，去除上層黃色血漿+生理鹽水溶液的組分，至渾濁白色PBMC帶的上方大約1~2cm的位置（位于血漿+生理鹽水溶液淡黃色組分和密度梯度分離介質溶液間）。按實驗室政策丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。（ 或者，上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色PBMC帶可通過上層小心插入移液器移至PBMC帶。）

(8)?使用無菌移液管，在PBMC帶（濁白處）收集所有細胞。注意不要吸入更多的分離介質溶液。

(9)?將收集到的細胞從一個錐形離心管轉移到另一個相應的、預標記的無菌離心管。離心管可以預先填充生理鹽水以節省時間。之后進行洗滌。

4.?重新蓋上裝有剩余紅細胞/分離物的錐形離心管。按照實驗室政策，將試管作為生物危害廢物進行培養基和丟棄。

流式細胞術

涉及到流式細胞儀的使用的一種免疫細胞分離技術，流式細胞儀是一種根據大小、形狀和熒光亮度等特征標記不同顆粒的儀器。這種方法被稱為熒光激活細胞分選(FACS)，它允許樣品流過一個管子，然后將成分分成不同的組。

FACS需要昂貴的設備和受過適當訓練的人員。這種技術在分選需要許多不同群體的不同細胞樣本時很有用，但使用這種方法分離白細胞非常耗時。通常，在使用流式細胞術處理之前，樣品應首先進行“制備”或清理，以分離原始樣品內容物的特定子集，這可以減少細胞分選所需的時間，因為機器將處理更小、更濃縮的樣品量。這樣還可以產生更多健康的、有活力的細胞，因為當處理時間大大減少時，自然細胞死亡就會減少。

Magnetic-activated cell sorting?(MACS) 磁激活細胞分選

另一種方法是將磁珠與靶細胞結合，并使樣品通過磁場，使附著磁鐵的細胞懸浮。磁激活細胞分選(MACS)比前面提到的兩種方法更快、更便宜，但它的細胞損失是三種方法中最高的。強烈的磁場會使細胞破裂、細胞器破裂、使樣品混亂。這種細胞外碎片可引起結塊和阻塞，從而導致較低的吞吐量。

隨著科技和技術的不斷進步，相信會有更好的免疫細胞分離技術不斷涌現，我們也會繼續關注相關發展，以便為顧客提供更好的服務。

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