柯達(dá)膠片 感藍(lán)
產(chǎn)品名稱： 柯達(dá)膠片 感藍(lán)
英文名稱： Kodak film
產(chǎn)品編號： XBT-1
產(chǎn)品價(jià)格： 0
產(chǎn)品產(chǎn)地： 進(jìn)口
品牌商標(biāo)： 柯達(dá)
更新時(shí)間： 2025-05-07T11:30:07
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柯達(dá)膠片（X光片） 感藍(lán) 5*7
柯達(dá)膠片（X光片） 感藍(lán) 8*10
該產(chǎn)品可應(yīng)用于western blot 實(shí)驗(yàn)中 最后顯影
western blot 實(shí)驗(yàn)相關(guān)流程
?Western Blot簡介
Western Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
Western Blot一般流程
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1、蛋白樣品制備：用于蛋白質(zhì)免疫印跡的樣品為蛋白質(zhì)的溶解液，可以是純化后的蛋白質(zhì)樣品，也可以是組織細(xì)胞裂解液。
2、蛋白定量：評估電泳上樣量或檢測蛋白含量大小。先總蛋白定量，western后在依據(jù)內(nèi)參定量。
3、電泳：依據(jù)需要檢測蛋白的分子量選擇膠的濃度，制膠，電泳。
4、轉(zhuǎn)膜：將聚丙烯酰胺上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至薄膜上，常用半干轉(zhuǎn)或濕轉(zhuǎn)。
5、封閉：選擇適當(dāng)封閉劑將膜上蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)封閉阻斷。
6、一抗孵育：一抗與特異性抗原的結(jié)合。
7、二抗孵育：二抗與抗原上結(jié)合的一抗的再結(jié)合過程。
8、底物顯色：二抗一般為標(biāo)記抗體，根據(jù)二抗上的標(biāo)記物來選擇顯色底物進(jìn)行檢測。
9、圖片分析：標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描 。
一、蛋白樣品制備與蛋白定量（單獨(dú)介紹）
二、蛋白凝膠電泳SDS-PAGE
SDS-PAGE原理：
蛋白質(zhì)既含有能解離成帶正電荷的氨基，又含有能解離成帶負(fù)電荷的羧基，可以進(jìn)行兩性電離。蛋白質(zhì)的電離受溶液pH值的影響，在酸性環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子電離成陽離子，在堿性環(huán)境中，則電離成陰離子。蛋白質(zhì)陰、陽離子在電場中分別向正、負(fù)電極移動，這種帶電荷的蛋白質(zhì)，在電場中向電性相反的電極移動的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳。
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (簡稱Acr) 和交聯(lián)劑N,N’—亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)
在催化劑作用下,聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠,并以此為支持物進(jìn)行電泳.聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶。
蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇等的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開， SDS能按一定比例與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷,掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異.因此，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷與分子形狀影響，只與蛋白質(zhì)分子量大小相關(guān)。
SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟：
1， 根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量大小，選取凝膠濃度，按下表配制。先配分離膠，再配濃縮膠。
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2， 將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液按比例混勻，100℃或沸水浴加熱3-5分鐘。
3， 安裝電泳槽，倒入電泳緩沖液。拔出梳子，將蛋白質(zhì)樣品與蛋白marker加到上樣孔內(nèi)。將電泳槽與電泳儀相接，調(diào)節(jié)電壓電流參數(shù)，開始電泳。
4， 觀察指示劑條帶電泳狀況，染料到達(dá)膠的底端附近即可停止電泳。
5， 取出PAGE凝膠，染色或進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。
6， 蛋白膠染色：
常用的凝膠上蛋白質(zhì)染色方法主要有染料染色法、銀染法、負(fù)染法和熒光染色法。實(shí)驗(yàn)室最常見的染色方法為考馬斯亮藍(lán)染色法。
配置考馬斯亮藍(lán)染液與脫色液，電泳完成后取出PAGE膠放入考馬斯亮藍(lán)染液中染色2小時(shí)左右，具體染色時(shí)間可根據(jù)蛋白樣品的豐度做相應(yīng)調(diào)節(jié)。脫色時(shí)將PAGE膠放到脫色液中，置于搖床上，期間可更換脫色液數(shù)次，脫色至蛋白條帶清晰顯示為止。經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白膠不建議再用于轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。
三、Western轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)
轉(zhuǎn)膜簡介：
將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機(jī)械裝置不同。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。
雜交膜的選擇是決定Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。
最常用于Western Blot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。
轉(zhuǎn)膜步驟（以槽式濕轉(zhuǎn)為例）
1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡5-10 min。
2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。
3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，趕去氣泡。
4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，設(shè)置電流電壓，開始電泳。
5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。
轉(zhuǎn)膜后檢測（可選步驟）
轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
轉(zhuǎn)膜完畢后，用TBS（或PBS）洗膜1-2分鐘，以洗去轉(zhuǎn)膜液。放入麗春紅染色液中染色。蛋白帶出現(xiàn)后水洗。
四、免疫反應(yīng)：
1，封閉
原理：用非抗原的蛋白去封閉膜的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，避免標(biāo)記抗體固定在膜上引起背景增高，常用的封閉液有BSA,脫脂奶粉,明膠, tween-20等,一般脫脂奶粉。
實(shí)驗(yàn)步驟：
5%脫脂奶粉（用1x TBS配制，或1xTBST配制）封閉過夜 或室溫1~2小時(shí)
2，一抗、二抗孵育
原理： 一抗可以與要檢測的蛋白特異結(jié)合，二抗可與一抗結(jié)合，同時(shí)二抗上帶有特異的酶（如辣根過氧化物酶HRP，堿性磷酸酶法AP等 ),標(biāo)記酶可以分解化學(xué)顯色底物產(chǎn)生有顏色的條帶或催化化學(xué)發(fā)光底物使膠片感光。
實(shí)驗(yàn)步驟：
一抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時(shí)或4度過夜（抗體濃度及孵育時(shí)間需根據(jù)不同的抗體做相應(yīng)調(diào)整， 1xTBST，洗膜3次，每次5分鐘。
二抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時(shí)， 1x TBST,洗膜3次，每次5分鐘。
五、底物顯色
Western底物顯色根據(jù)二抗的性質(zhì)來選擇，熒光標(biāo)記二抗孵育后可用熒光掃描系統(tǒng)掃膜成像。酶標(biāo)記二抗根據(jù)酶的種類來選擇顯色底物。酶促反應(yīng)可以搭配不同的底物從而實(shí)現(xiàn)不同的顯色方法：化學(xué)發(fā)光和底物顯色。最常用的為辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記二抗和堿性磷酸酶AP標(biāo)記二抗：
Western blotting中HRP的常用生色底物顯色有DAB， AEC等，ECL是是經(jīng)典的HRP化學(xué)發(fā)光底物。AP的常用生色底物顯色有BCIP/NBT。
1． HRP-ECL發(fā)光法： 將按說明配置顯色底物，混合物覆蓋在膜表面。 用保鮮膜把膜包起來，放入夾板中。 在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即顯影、定影。標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間和曝光區(qū)域，得到最佳結(jié)果。
2． HRP-DAB顯色：
膜在抗體孵育后適當(dāng)洗滌，配置DAB工作液。向膜上加入適量DAB工作液，覆蓋樣品。 室溫避光孵育至顯色至預(yù)期深淺。 洗滌終止顯色反應(yīng)。分析拍照。膜可室溫晾干避光保存。
相關(guān)試劑：
SDS-PAGE電泳：
蛋白膠配置：
P1300 SDS-PAGE凝膠制備試劑盒
A1010 30%丙烯酰胺(29:1)（丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺）
T1020 1M Tris-HCL (PH6.8)
T1010 1.5M Tris-HCL (PH8.8) （T8060 TRIS）
A1030 10%過硫酸銨[AP,APS] （A8090 過硫酸銨）
S1010 10%SDS （S8010 SDS）
T8090 TEMED
A1012 丙烯酰胺溶液（定制）
A1025 40%丙烯酰胺（37.5:1）
S1051 4×SDS-PAGE分離膠緩沖液（PH=8.8）
S1052 4×SDS-PAGE濃縮膠緩沖液（PH=6.8）
D1070 1M DTT（D8220 DTT）
蛋白電泳：
PR1300 超低分子量蛋白MARKER
PR1400 低分子量蛋白MARKER
PR1500 次高分子量蛋白MARKER
PR1600 預(yù)染低分子量蛋白MARKER
PR1700 預(yù)染次高分子量蛋白MARKER
PR1800 Western blotting蛋白MARKER
P1015 4×蛋白上樣緩沖液（含DTT）
P1016 4×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）
P1017 4×非變性蛋白上樣緩沖液
P1018 2×蛋白上樣緩沖液（含DTT）
P1019 2×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）（B8120 溴酚藍(lán) G8190 甘油 S8270蔗糖 M8210β-巰基乙醇）
T1070 5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（G8200 甘氨酸）
P1300-500 考馬斯亮藍(lán)快速染色液（C8420 考馬斯亮藍(lán)G-250、C8430考馬斯亮藍(lán)R-250）
P1305 考馬斯亮藍(lán)染色套裝（染色液+脫色液）
R8070 剝離硅烷
B8150 親和硅烷
轉(zhuǎn)膜：
印記膜：尼龍膜、PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）
3030 3MM濾紙
P0012 10×麗春紅（P8330麗春紅S）
D1060 10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液
封閉、抗體孵育：
T1080-500 20*TBS
T1081-500 10*TBST
T1085-500 1*TBST（T8220吐溫 -20）
SW3010 膜封閉液
SW3015 5%BSA封閉液（A8010、A8020、126575牛血清白蛋白BSA）
D8340 脫脂奶粉
C8200 酪蛋白
SW3020 膜再生液
抗體：一抗、二抗
SE系列 HRP標(biāo)記二抗、SF系列FITC標(biāo)記二抗
SH1酶標(biāo)記親和素HRP 、SHB2生物素化羊抗人IgG
A1800 抗體稀釋液（普通型）
A1810 一抗稀釋液
A1820 HRP標(biāo)記抗體稀釋液
A1830 AP標(biāo)記抗體稀釋液
A1840 熒光抗體稀釋液
Western信號檢測：
PR1100 BCIP/NBT地物顯色試劑盒（B8090 BCIP、N8140 NBT）
A2010 AEC顯色試劑盒（20×）（A5754 AEC）
DA1010 DAB顯色試劑盒（20×）（D8230 DAB-4HCL）
PE0010 ECL Plus熒光檢測試劑(ECL超敏發(fā)光液)
PE0010 ECL Plus熒光檢測試劑(ECL超敏發(fā)光液)
PE0010 ECL Plus熒光檢測試劑(ECL超敏發(fā)光液)
SW1010 Western blotting（小鼠IgG）DAB法顯色試劑盒
SW1020 Western blotting（兔IgG）DAB法顯色試劑盒
SW1030 Western blotting（山羊IgG）DAB法顯色試劑盒
SW1040 Western blotting（小鼠/兔IgG）DAB法顯色試劑盒
SW2010 Western blotting（小鼠IgG）ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒
SW2020 Western blotting（兔IgG）ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒
SW2030 Western blotting（山羊IgG）ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒
SW2040 Western blotting（小鼠/兔IgG）ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒
XYF 顯影粉
DYF 定影粉
AH 暗盒
增感屏
JPKD-5*7膠片
產(chǎn)品訂購說明：
1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨，一般情況下都能訂貨當(dāng)日發(fā)貨。?
2、部分非常用產(chǎn)品，需提前1－2日預(yù)訂，海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂。?
3、部分產(chǎn)品價(jià)格會因貨期、批次等因素發(fā)生變化，若有變動以訂貨當(dāng)日最新價(jià)格為準(zhǔn)。?
4、每日訂單截止時(shí)間為16點(diǎn)整，部分城市可到17點(diǎn)整，因超過截止時(shí)間造成當(dāng)日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
5、請辦理完貨款后，將收據(jù)、底單等連同收貨人的地址、姓名、電話等以傳真、EMail、短信、電話等形式通知我們。?
6、詳情請咨詢010-56371206
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