熒光定量PCR
產(chǎn)品名稱： 熒光定量PCR
英文名稱： RT-PCR
產(chǎn)品編號(hào)： 0
產(chǎn)品價(jià)格： 0
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更新時(shí)間： 2025-11-10T13:55:27
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• Taqman 技術(shù)：該技術(shù)以美國 ABI 公司為代表。 PCR 擴(kuò)增時(shí)，在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收， PCR 儀檢測不到熒光信號(hào)； PCR 擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段）， Taq 酶的 5' － 3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。
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ABI公司
Taqman探針的合成標(biāo)記
Sybr green I熒光染料
熒光定量PCR Taq酶
熱啟動(dòng)熒光PCR定量核心試劑盒
熒光定量PCR一步法RT－PCR試劑盒
TrizolRNA提取試劑
UNG酶
dUTP
• Beacon 技術(shù)：該技術(shù)以美國人 Tagyi 為代表。也是加入了熒光探針，但它是 環(huán)狀的寡核苷酸探針，分別由莖部和環(huán)部組成， 兩端分別標(biāo)記 熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)，在無靶序列的情況下，探針始終是環(huán)狀，報(bào)告基團(tuán)的熒光被猝滅基團(tuán)猝滅，使熒光檢測儀檢測不到熒光信號(hào)；而在有靶序列時(shí)，即在 PCR 的退火階段探針與靶序列結(jié)合，使熒光報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開，這樣熒光儀可以檢測到熒光，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。
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分子信標(biāo)知識(shí)介紹
• FRET 技術(shù)：該技術(shù)以 Roche( 羅氏公司 ) 為代表。它的基本原理是：兩條直線型寡核苷酸探針，其中一條的 3 ‘端標(biāo)記熒光激發(fā)基團(tuán)，另一條的 5 ' 端標(biāo)記熒光檢測基團(tuán)，在無靶序列的情況下，兩條探針分開，無法進(jìn)行能量的傳遞，這樣熒光儀不能檢測到熒光信號(hào)；而當(dāng)有靶序列時(shí)，即在 PCR 的退火階段兩條探針與靶序列結(jié)合，使得兩條探針上的熒光基團(tuán)可以進(jìn)行能量的傳遞，這樣熒光儀就可以檢測到熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。
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Lightcycler University
實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的幾個(gè)俗語
• Ct 值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。（如圖所示）
• 熒光域值（ threshold ）：是指 PCR 反應(yīng)的前 15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍，即： threshold
• Ct 值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個(gè)模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系〔 1 〕，起始拷貝數(shù)越多， Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代 Ct 值（如圖 2 所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
• 可以對各種基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，如：同一基因在不同組織中的表達(dá)差異、同一基因在不同藥物處理后的表達(dá)差異、轉(zhuǎn)基因食品的檢測。過去最常用的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)是 cDNA 芯片和差異顯示，但這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)是只能定性而非完整意義上的定量分析。實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)和高通道實(shí)時(shí) PCR 儀的出現(xiàn)，無疑為這種檢測提供了極大的方便。
• 可以進(jìn)行點(diǎn)突變分析和等位基因分析，用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記 Taqman 探針，然后分別與野生型和突變型雜交，如果一種熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于另一種熒光信號(hào)，則表明它是純合子；如果兩種熒光信號(hào)都明顯增強(qiáng)，則表明它是雜合子。另外分子信標(biāo)（ Molecular Beacon ）就是專門為這種技術(shù)設(shè)計(jì)的探針。
• 可以進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的分析，檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個(gè)體對不同疾病的易感性或者個(gè)體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的 SNP 檢測將會(huì)變得簡單而準(zhǔn)確。
• 可以進(jìn)行 DNA 甲基化檢測， DNA 甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥， Laird 報(bào)道了一種稱作 Methylight 的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman 探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
• 對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，這在我國應(yīng)用比較廣泛，大家比較熟悉。許多生產(chǎn)臨床 PCR 試劑的廠商已經(jīng)陸續(xù)推出了一系列的診斷試劑，如：肝炎系列、性病系列、腫瘤系列等等 詳情請登入 http://www.shinegene.org.cn 或來電 021-54460832