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一、無損傷鈣離子探針“GCaMP-X”

? ? ? ??北京航天航空大學劉曉冬課題組獨家授權！歡迎咨詢！

GCaMP-X優勢：
1. 精準、特異且安全無損；
2. 特別適合超長時程（≥4周）鈣信號的監測。

測試結果：
測試病毒：AAV-hSyn-GCaMP6m-XC，滴度：1.0x10^12，血清型：2/9；
對照病毒：AAV-hSyn-GCaMP6m，滴度：1.2x10^12，血清型：2/9；
注射區域：在同一只小鼠左腦皮層區域注射GCaMP6m，右腦皮層區域注射GCaMP6m-XC；
注射量：各100 nl。

圖一：同一只小鼠左右腦皮層分別注射GCaMP6m和GCaMP6m-X_C病毒，表達3周時長，左腦皮層神經元出現GCaMP6m顯著進核現象，而右腦皮層神經元GCaMP6m-X_C無進核現象。


? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖一、 病毒注射3周后表達狀態對比（劉曉冬課題組提供）

圖二：步驟同上，表達13周時長，左腦皮層神經元GCaMP6m顯著進核，而右腦皮層神經元GCaMP6m-XC依然無進核現象。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖二、 病毒注射13周后表達狀態對比（劉曉冬課題組提供）

注意：低滴度GCaMP6m-XC表達量相對較低，可能會不利于在體雙光子實驗，推薦使用者使用10^13高滴度病毒，可有效提高表達量，有利于在體雙光子實驗。

二、相關原理：
? ? ?許多重要的生物學過程如增殖、轉錄、代謝、胞吐、收縮和凋亡等都有Ca2+的參與，因此，人們付出了巨大的努力來開發和改進分子工具來監測和量化細胞Ca2+的時空動態。利用基因編碼鈣離子指示劑(GECIs)進行熒光成像，在細胞群、單個細胞或亞細胞水平上檢測Ca2+取得了快速進展。鈣離子成像技術是利用可以感應Ca2+濃度的鈣離子指示劑，檢測的是細胞或組織中Ca2+的濃度變化，將鈣濃度變化轉化為熒光信號，從而使細胞電活動轉化為可記錄的光信號。鈣離子指示劑分為兩種，一種為化學指示劑，另一種為現在普遍使用的遺傳編碼指示劑，例如GCaMP。GCaMP由綠色熒光蛋白（green fluorescent protein , GFP）、鈣調蛋白（calmodulin, CaM）和肌球蛋白輕鏈激酶的一段肽段序列M13構成。當有Ca2+結合CaM時，CaM發生構象變化，其輕鏈區可以結合M13，致使GFP在特定波長的光照下其發色團的質子化作用增強，吸光度增加從而使GFP發出強烈的熒光。

? ? ? ? ? ? ? ? ? GCaMP的結構及作用示意圖（來源于維基百科）

? ? ? ? ?然而，據報道GCaMP在多個方面造成了意想不到的“副作用”，主要是GCaMP引起的細胞損傷。GCaMP可能損害細胞和組織的整體健康，例如GCaMP2轉基因小鼠心臟的心肌肥大【1-2】，以及神經元的細胞毒性或死亡【3-4】；在GCaMP5轉基因小鼠的海馬神經元中觀察到放電頻率的增加【5】。這些副作用似乎與GCaMP在細胞核內的異常堆積密切相關，通常伴隨著神經元內Ca2+動力學的衰減【3-4, 6】。

? ? ? ? ? 2018年4月17日，北京航空航天大學生物醫學工程高精尖創新中心劉曉冬研究組在《Nature Communications》在線發表了題為“Improved Calcium Sensor GCaMP-X Overcomes the Calcium Channel Perturbations Induced by the Calmodulin in GCaMP”的論文。該研究首次揭示了含有CaM的GCaMP干擾了L型鈣通道(CaV1)的門控和信號傳導，破壞Ca2+動力學和基因表達，并通過GCaMP氮端引入能夠特異結合apoCaM的保護元件，設計出了新一代無損傷鈣離子探針——GCaMP-X，有效地保護了依賴于CaV1的興奮-轉錄耦合免受干擾，同時仍表現出部分GCaMP的優良Ca2+感應特性。

GCaMP干擾神經元L型電壓門控鈣通道（CaV1.3）

? ? ? ?CaV1.3是神經元表達的CaV1通道的一個主要亞型，與細胞核內的轉錄信號緊密耦合。作者發現，GCaMP能與CaV1.3結合，導致CaV1.3的門控顯著增強，鈣離子內流增加（圖1）。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖1. GCaMP干擾神經元L型電壓門控鈣通道（CaV1.3） ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
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GCaMP導致神經元退化和凋亡

作者還發現，GCaMP也會干擾CaM正常情況下響應CaV1.3鈣信號的核遷移過程，長時程表達時引發GCaMP異常核聚集。入核GCaMP擾亂了轉錄因子CREB信號通路的正常運轉，導致神經元退化和凋亡（圖2）。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2. GCaMP導致神經元退化和凋

GCaMP-X避免了對鈣通道門控的干擾
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? ? ? ? 作者在GCaMP氮端引入了特異性apoCaM保護元件，合成了新一代鈣離子探針——GCaMP-X。GCaMP-X有效地解決了有害核積累、急性和慢性Ca2+失調、轉錄信號異常和細胞形態異常等問題，同時仍表現出GCaMP的優良Ca2+感應特性（圖3）。


? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖3. GCaMP-X避免了對鈣通道門控的干擾

GCaMP-X在長時程的鈣離子監測中更有優勢

? ? ? ??作者用電穿孔法在機械敏感的外毛發細胞中轉染GCaMP6m或GCaMP6m-XC，在短時間的細胞培養中（1天，DIV1），GCaMP6m-XC與GCaMP6m在監測Ca2+信號時無明顯差異。而在較長時間的細胞培養( 3天，DIV3)中，GCaMP6m的副作用(例如干擾外毛發細胞中的CaV1.3)將出現。將100、300或500 ms的射流脈沖施加到細胞上，與表達GCaMP6m-XC的細胞相比，GCaMP6m表現為較弱的Ca2+信號反應，引起了Ca2+信號的衰減，而GCaMP6m-XC避免了這個問題（圖4）。

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? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖4. GCaMP6m-Xc與GCaMP6m的鈣離子監測比較

? ? 作者進一步在GCaMP碳端加入定位序列，如：檢測近膜鈣信號的GCaMP-X_M探針，以及特異性定位于細胞核的GCaMP-X_N探針，以實現監測胞質、膜下和核鈣信號，滿足不同實驗研究的需要。新一代無損傷探針GCaMP-X有效地解決了傳統GCaMP探針的弊端，能夠安全無損、長時程、精準、特異、多細胞器的定量鈣信號監測。這項研究也對未來基于CaM的分子工具的設計有指導意義。

? ? ? ? ? ?劉曉冬課題組致力于如下幾個方面的研究：1）電壓門控鈣通道CaV門控-信號耦聯（如興奮-轉錄耦聯）機制及調控；2）基于新型鈣探針GCaMP-X的長時程、亞細胞鈣信號定量監控；3）感覺刺激響應型鈣通道TRP的結構-功能研究；4）重要鈣通道的病生理關聯。此論文是該實驗室繼前期工作（《自然》Nature 2010；《細胞?報告》 Cell Reports 2015；《e生命》eLife 2017；及《自然?通訊》 Nature Communications 2018等）的最新研究進展。該項研究得到了國家自然科學基金委、北京市自然科學基金委、清華大學麥戈文腦科學研究所等方面的支持。
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三、樞密科技GCaMP-X產品列表：