?? ??DNA羥甲基化測序（hMeDIP-Seq）服務
? ? DNA羥甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，對基因的表達起調控作用，在神經分化和癌癥中發揮重要的作用。為深入了解5hmC的作用，我們就必須清楚5hmC在基因組的分布情況。然而，傳統的基于重亞硫酸鹽的方法無法區分5-hmC和5-mc。5-hmC單克隆抗體捕獲法是研究DNA羥基化修飾的利器，結合高通量測序技術以及生物信息分析，可以獲得全基因組羥甲基化分布圖，從而能幫助我們從一個新的角度來解析胚胎發育，神經細胞分化以及癌癥發生的分子機制。
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康成生物為您提供羥甲基化測序技術服務，您只需要提供保存完好的組織或細胞標本，康成的技術服務人員就可為您完成全部實驗操作，包括超聲打斷基因組、羥甲基化DNA免疫共沉淀、hMeDIP與 Input DNA文庫構建、高通量測序和數據分析、并提供完整的實驗報告。
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DNA羥甲基化測序技術優勢
*? 特異性檢測羥甲基化： 5-hmC抗體能夠區分甲基化和羥甲基化信號，特異性的檢測羥甲基化區域。
*? 靈活度高：能夠直接對任意物種的高羥甲基化片段進行測序，無需已知的基因組序列信息。
*? 檢測范圍廣：覆蓋整個基因組范圍的羥甲基化區域。
*? 精確度高：能夠在實際結合位點50個堿基范圍內精確定位。
*? 數字化信號：直接對羥甲基化片段進行測序和定量，不存在傳統芯片雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題。
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康成生物提供的DNA羥甲基化測序服務流程
1.??羥甲基化DNA免疫共沉淀（hMeDIP）
2.? 測序文庫構建
3.??DNA成簇（Cluster）擴增
4.??高通量測序
5.??數據分析
6.??提供實驗報告
康成hMeDIP-seq技術服務優勢
*? hMeDIP富集效果特異性佳：hMeDIP是獲得準確測序數據的關鍵。康成hMeDIP平臺經過不斷地優化，抗體富集效率高和特異性好。
*? 嚴格的質控體系：康成生物在hMeDIP-seq每個關鍵步驟都加入了 質控實驗（圖2，3）。這些QC數據能夠評估每個步驟的質量。如果達不到標準，我們會重復實驗步驟或者優化實驗體系，使得每個樣品都能夠順利進入下個實驗環節。
圖2. hMeDIP-seq技術服務流程和關鍵步驟的質量控制
圖3. hMeDIP-qPCR 質控。hMeDIP特異地富集羥甲基化的Spike-in序列，且陽性信號遠高于背景噪音。
*? 優化的文庫制備流程: 起始量少至1μg乃至更少量的起始DNA樣品即可進行羥甲基化測序實驗；同時，對hMeDIP富集過程及測序文庫嚴格的質量監控保證了高品質的測序結果。
*? 對DNA羥甲基化水平進行數字化定量分析：通過對測序得到的大量序列進行深入分析，hMeDIP-seq得到的序列信息能夠轉換為可定量的羥甲基化水平信息。對基因組任意區域的羥甲基化水平給出定量的結果，并分析差異羥甲基化的區域。
*? 可視化分析: 提供50bp精度的全基因組DNA羥甲基化信號可視化數據。通過UCSC基因組瀏覽器（UCSC genome browser），任意區域的羥甲基化水平能夠直觀的進行展示和比較。
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康成基本數據分析結果展示
·全基因組羥甲基化譜
1.??羥甲基化峰識別：通過MACS軟件，可以利用與基因組匹配的read來識別羥甲基化峰，常用的MACS篩選參數：FDR<0.01。
上表： 全基因組羥甲基化譜數據列表
2.??羥甲基化峰注釋：利用最新的RefSeq數據庫，通過每個峰通過與其最鄰近基因位置關系對羥甲基化峰進行注釋，分成：啟動子峰，外顯子峰，內含子峰，非翻譯區峰，基因間羥甲基化峰。
上圖： 利用全基因組羥甲基化譜數據作出的不同樣品間的羥甲基化峰分布圖。
3.??啟動子區的羥甲基化譜: 已有的研究表明基因啟動子區域的DNA羥甲基化在基因表達調控中發揮著重要的作用，為了方便客戶的研究。康成生物專門將基因啟動子區域的羥甲基化峰挑出來，并對它與鄰近基因的關系以及鄰近基因的功能進行了詳細的注釋。
·差異羥甲基化區域
1.??識別差異羥甲基化基因：通過MACS軟件，康成生物對不同樣品或樣品組間的基因啟動子區域的差異羥甲基化進行了分析。為了對羥甲基化水平進行定量分析，處理組和對照組的樣品分別通過相應的input樣品進行標準化。根據處理組樣品羥甲基化水平相對對照組的上下調情況，這些在啟動子區域差異羥甲基化的基因被分成了“重新羥甲基化”（de novo methylation）和“去羥甲基化”（de-methylation）基因。
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去羥甲基化的基因
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超羥甲基化的基因
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2.??差異羥甲基化基因的聚類分析???
???? 聚類分析對于理解差異羥甲基化基因的功能、調控是十分有幫助的。具有相似羥甲基化模式的樣品能夠被聚類在一起，以揭示難以用傳統方法鑒定的潛在信息。
上圖：差異羥甲基化的基因聚類分析實例。
3.??差異羥甲基化基因的GO分析 ???? 為了方便客戶了解啟動子差異羥甲基化基因的功能，康成生物還分別提供了去羥甲基化基因和超羥甲基化基因的GO分析。
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4.??差異羥甲基化基因的Pathway分析
???? 為了方便客戶了解啟動子差異羥甲基化基因參與的生物學過程，康成生物還分別提供了去羥甲基化基因和超羥甲基化基因的Pathway分析。
·可視化
?? ? 康成生物提供WIG 格式的hMeDIP-Seq羥甲基化譜數據，可以通過UCSC瀏覽器或IGB瀏覽器進行可視化。通過可視化話圖，客戶可以直觀的了解具體區域或基因的羥甲基化情況，已經樣品間的差異羥甲基化狀況。
案例分析——DNA羥甲基化測序(hMeDIP-Seq)
Loss of 5-hydroxymethylcytosine is an epigenetic hallmark of melanoma. Cell 2012?
???? 研究者先用免疫組化的方法證明黑素素瘤組織和正常痣相比羥甲基化程度降低。對70個病人的DNA羥甲基水平進行檢測，結合臨床數據證明DNA羥甲基化水平可以作為黑色素瘤的預后標志物。然后采用hMeDIP-seq的方法，在全基因組范圍內研究黑色素瘤羥甲基化變化的分布位點。5-hmC是5-mC在TET酶的催化作用下轉化而來的，因此研究者進一步結合hMeDIP-seq的數據，找到5-hmC水平降低（>5倍）同時5-mC水平降低（<2倍）的基因2，144個。進而通過pathway分析，發現這些基因主要富集在wnt signal pathway，細胞連接等和黑色素瘤相關的信號通路中（圖7），從一個方面說明了癌癥發生的分子機制。應用hMeDIP-PCR的方法對IGF1R,RAC3, TIMP2基因進行了羥甲基化水平的檢測，驗證了測序結果的準確性。
???? 接著，研究者找到了黑色素瘤中整體羥甲基化水平降低的根本原因：羥甲基化形成的關鍵酶TET2，IDH2表達量在黑色素瘤組織中表達下調。用黑素素瘤斑馬魚活體實驗證明，恢復IDH2的表達，可以使癌組織中DNA羥甲基化的水平升高，并且使動物模型的無病生存期延長。進一步進行細胞水平的實驗，在黑素素瘤細胞中過表達TET2，結果表明黑色素瘤在過表達TET2后，增殖和侵襲能力降低。應用hMeDIP-seq對過表達TET2的黑色素瘤細胞和對照細胞進行羥甲基化檢測，發現30%在黑色素瘤中羥甲基化水平降低區域在過表達TET2后羥甲基化水平得到恢復。Pathway分析表明過表達TET2后羥甲基化水平恢復的基因聚集在MAPK等重要的信號通路中。該成果發表在Cell上，IF 31.957。
技術路線
結果展示
上圖：黑色素瘤細胞中關鍵基因發生羥甲基化水平變化。A：UCSC可視化結果展示。黑色素瘤和痣組織相比整體羥甲基化水平減低，羥甲基化水平不變。B：對黑色素瘤和痣組織中檢測到的DNA羥甲基化位點和羥甲基化位點進行分類統計。黑色素瘤與痣組織相比，在啟動子，外顯子，內含子，基因間等區域羥甲基化水平下降，羥甲基化水平基本不變。 C: 基因內部（Gene body）及周邊(向兩端各延伸20%)區段內的羥甲基化和羥甲基化reads（讀段）密度分布。可以看到在黑色素瘤中，Gene body 內羥甲基化水平降低。E: 韋恩圖顯示癌組織中在Gene body區域羥甲基化水平降低同時羥甲基化水平升高的基因有2，144個。對這些基因進行pathway分析，發現變化的基因主要聚集在癌癥相關的信號通路中。F： UCSC可視化結果展示，在RAC3,? IGF1R, TIMP2中羥甲基化水平降低，羥甲基化水平升高。 G：hMeDIP-PCR對RAC3，IGF1R，TIMP2進行驗證，證明在黑色素瘤中這些基因的羥甲基化水平降低，驗證了測序的結果。
上圖：過表達TET2后部分關鍵基因的羥甲基化水平得到恢復。構建TET2過表達的黑素素瘤細胞系，同時構建TET突變的細胞系作為對照。通過hMeDIP-seq檢測，發現過表達TET2的細胞vs對照細胞 80%(12，752/15835)的羥甲基化升高的位點與黑色素瘤組織vs痣組織羥甲基化水平降低的位點重疊。將重疊的位點按照與基因的相對位置分成啟動子和Gene body兩個部分，分別進行GO和pathway分析。啟動子重疊的基因聚集在信號傳導，TGF-beta等重要的功能分類中；Gene body重疊的基因集中在MAPK， 細胞黏附等重要的通路中。
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