?Illumina 850k (EPIC)甲基化芯片服務

DNA的甲基化修飾是表觀遺傳研究中的一個熱點，在基因調控過程中扮演著重要的角色。它在維持組織特異性表達譜，使細胞獲得并保持特定狀態中起著重要作用。同時也調控著染色質穩定性、印跡基因表達調控、X染色體失活及抑制病毒和外源基因的表達等生物過程。更重要的是，在許多復雜疾病或生命過程的發生、發展中，也與DNA甲基化對基因的表達調控密切相關，這些疾病包括：癌癥、神經系統紊亂、老化以及發育。

?Illumina在原450K芯片巨大成功的基礎上，推出了新一代的DNA甲基化芯片Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（下文中以850K芯片代稱），為研究者提供了一個可靠且經濟高效的甲基化分析平臺。850K芯片可檢測人全基因組約853,307個CpG位點的甲基化狀態，其中包含了原450K芯片91%的位點，并增加了413,745個位點（圖 1）。850K芯片不但保持了對CpG島，基因啟動子區的全面覆蓋，還特別加強了增強子區（新增了333,265個探針覆蓋來自ENCODE及FANTOM5計劃的增強子）以及基因編碼區的探針覆蓋。廣泛應用于干細胞研究、腫瘤和其他復雜疾病研究，是目前最適合表觀基因組全關聯分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。

芯片特點：

·?????? 覆蓋全面：檢測853,307個CpG位點；全面覆蓋CpG島、啟動子、編碼區及增強子。

·?????? 無需“甲基化DNA免疫共沉淀”，亞硫酸氫鹽處理基因組DNA即可進行芯片實驗； Infinium探針設計，直接識別甲基化位點；

·?????? 技術重復重現率>98%；

·?????? 操作簡單，無須PCR擴增；模板量可低至250ng；

·?????? 適用于FFPE樣品。

圖 1 Illumina Infinium MethylationEPIC (850K)芯片與450K芯片的異同

Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片對全基因組的全覆蓋

? ? ??850K芯片對基因組的功能元件提供了空前全面覆蓋：CpG島、RefSeq基因、ENCODE開放染色質、ENCODE轉錄因子結合區以及FANTOM5增強子。領先的Infinium HD技術的保證了目標區域超高密度覆蓋，同時還避免了甲基化DNA捕獲方法具有偏向性的缺點。850K芯片的一大特點是增加了很多由ENCODE項目中鑒定出來的潛在增強子。（ENCODE通過全面分析開放染色質、FAIRE實驗、轉錄因子結合區域，整合出基因組中最活躍的區域。）最后，芯片還覆蓋了FANTOM5項目鑒定得到的不同組織類型中的增強子。下圖及表格統計展示了850K芯片對于不同染色體、基因組功能元件的覆蓋及分布。以上的設計不但可從泛-增強子及編碼區域角度分析甲基化組，還在全基因組表觀遺傳關聯研究（EWAS）中發揮重要作用。850K芯片中所包含的系列有價值的位點：

·?????? CpG島以外的CpG位點

·?????? 人類肝細胞中的非CpG甲基化位點（CHH位點）

·?????? 腫瘤（多種類型的癌癥）VS正常樣本中的不同甲基化位點，可以檢測多種樣本類型

·?????? FANTOM5增強子

·?????? ENCODE開放染色質和增強子

·?????? 脫氧核糖核酸酶超敏位點

·?????? miRNA啟動子區域

·?????? 涵蓋Infinium Methylation 450 BeadChip芯片中的＞90%的內容

圖 2 850K芯片探針在不同染色體及基因組功能元件中的分布。

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芯片數據的可靠性

? ? ??Methylation EPIC BeadChip沿用了在450K芯片中取得成功的Infinium I及II探針設計（Figure 4）,以達到保證數據穩定可靠的同時也達到對目標區域全面覆蓋。Infinium II探針對目的CpG位點采用單個探針且序列中包含簡并堿基設計，即使序列中有多達三個CpG位點的甲基化狀態影響也不會對目的位點的結果造成影響。Illumina的科學家嚴格檢測每個產品，以確保強大而重復的性能，讓研究人員能夠實現行業領先的數據質量。

（1）Infinium Ⅰ 探針設計

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? ? ??在InfiniumI設計中對于每個甲基化位點，都對應設計有兩種探針：M型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部為G，用來檢測甲基化位點（C）。U型磁珠尾部為A，用來檢測未甲基化位點(T)。根據單堿基延伸的原理，僅當探針最后一個堿基與模板配對時，熒光標記的核苷酸才能摻入并被檢測到熒光信號。通過分析M型與U型磁珠熒光信號的結果計算甲基化值。

（2）Infinium Ⅱ 探針設計

? ? ??Infinium Ⅱ 探針只使用一種磁珠，探針末端為C，與目的位點的前一個堿基配對，只延伸一個堿基（ ddNTP-BioT， ddNTP-DNP）分別與非甲基化或甲基化位點配對。根據兩種熒光類型及計算目的位點的甲基化程度。
基于Infinium平臺的可靠性，850K芯片表現出非常完美的重復相關系數（r2＞0.98），而且850K芯片與450K芯片相同的位點的重復r2＞0.98，為850K與450K數據的整合分析建立了基礎。此外通過比較8個生物學樣品的重復的結果，850K芯片能可靠檢測0.2的delta-beta值，且假陽性率低于1%。此外，芯片中設計了樣品依賴和樣品不依賴的內參以保證數據的高質量，例如專為亞硫酸氫鹽轉化后而復雜度降低序列而設計的陰性對照。

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圖 3 EPIC芯片自身技術重復間的相關性以及與450K相同探針間的相關性R方都在0.98以上。

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850K芯片適用于FFPE樣品的甲基化研究

? ? ??Illumina為FFPE樣本的檢測改進了protocol，以獲得更可靠成穩定的結果。通過與新鮮樣本的比較，可見雖然FFPE樣本的檢出率受到樣本質量的影響而下降，但FFPE樣本的技術重復的相關性R平方仍然高達0.98。對同一份樣本的冰凍樣本及FFPE樣本的結果比較發現兩者相關依然很高（R=0.994）。

圖 4 850K芯片用于FFPE樣本時的技術重復相關性（R2>0.98）及檢出率(>90%)；相同標本分別用FFPE處理與冰凍效果相比，重復相關性（R=0.994）。?

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三、樣本要求：

樣品類型：組織、細胞、基因組DNA

·?????? 樣品純度：OD 260/280值應在1.7～2.0 之間；RNA 應該去除干凈；不得有其它個體或其它物種的DNA污染。

·?????? 樣品濃度：濃度不低于50ng/μl；

·?????? 樣品總量：每個樣品總量不少于1μg 。

·?????? 樣品溶劑：溶解在TE中。

·?????? 樣品運輸： DNA低溫運輸（-20℃）；在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現污染。