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小鼠心肌細胞培養

原代培養心肌細胞作為一種主要的研究模型，被廣泛應用于心血管研究之中，我中心擁有專業的細胞培養技術平臺，為客戶提供心肌培養技術服務。

實驗步驟

小鼠心肌細胞培養過程：

?1.?把兩個5ml注射器分別插入DMEM和胰酶中，分別向兩個圓皿中加入5ml的DMEM培養液。用一把大鑷子從鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入0.1％新潔爾滅浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用針頭把鼠固定（位置擺正），用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘，取一把小剪子及小鑷子開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒，后換另一把小剪子和鑷子在劍突處正中線稍偏左開胸取心。

2.?取出的心放在剛才準備的一個裝有DMEM的圓皿中再取下一只。重復以上過程。（鼠全部殺死后，把取鼠鑷及泡沫板、新潔爾滅缸等拿出臺面。消毒、清潔，鋪紗布、換手套。

3．用第三副剪子和鑷子把圓皿中的心臟周邊的血凝及纖維組織剔除掉，放在另一個預先裝好DMEM的圓皿中。抽取5ml的胰酶，然后將其中少許放入50ml的小燒杯中，大部分倒入三角燒瓶中。用第四副剪子將燒杯中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入三角燒瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷凈燒杯。

4．把溫度計和三角燒杯放入250ml燒瓶中，（事先調好水量，多會沒過三角燒杯，少溫度會不均勻）。打開磁力攪拌器電源，調溫度（使-緩慢加到34~35℃）和轉速（轉速不可過快，否則會打碎細胞，基本上標志為平行）。一定要注意監控。

5．溫度達到34℃時開始計時，第一次為10分鐘，以后可為8分鐘，事情況而定。在此期間，在試管架上擺上5、6個離心管，標上1、1，2、2。其中在1號兩管事先加入DMEM液各2毫升。

6．10分鐘后，把三角燒瓶取下，磁力攪拌器關上，用一個吸管輕輕吹打（使消化下來的細胞徹底從組織團快上掉下來），這個吸管（1）用后固定放在一個離心管中，以后每次消化后取下都用其吹打幾下，第一次上清棄去，然后向兩個1號管分別倒入2ml上清（盡量不要把組織倒出，也不要剩液太多，以免消化下的細胞重復消化造成損傷），用另一個吸管（2）混勻配平兩個管（即兩個管水平高度相同），輕輕吹打，以免損壞細胞。

7．接著把這兩個離心管放入離心機中，調10分鐘，800或1000轉，墊小鎖，打開關。
8．同時向三角燒瓶中加入5ml胰酶，繼續消化8分鐘，注意控制溫度。此時向兩個2號管中分別加入2mlDMEM液。

9．取下三角燒瓶，仍用1號吸管吹打，后靜置片刻向兩個2號管分別倒入2毫升的上清，取出兩個離心后的1號管，把上清液沿細胞貼壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2號吸管取少量液體加入另一個離心管中，把管底的沉淀細胞洗下來，把液體全部移入其中一管，三個管（1個1號管，兩個2號管）配平，放入離心管中，離心十分鐘。同時仍加5ml的胰酶，放入三角燒瓶中，繼續消化（注意控制溫度，達34℃時計時）。

10．消化到4次左右，吹打均勻后，吸一滴滴在載玻片上，拿到鏡下觀察消化情況，決定消化次數。

11．離心2次的吸管，放在試管架上，待離心過程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精確，大致這樣）DMEM液，記住共加入多少DMEM液的量，換吸管（3號）把各管底細胞塊吸下吹打均勻后，移入50ml燒杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入燒杯中，加入小牛血清及抗生素，換吸管（4號）吹打均勻。

12．取出24孔培養板，一個人吹打，另一個人用加樣器加藥。封蓋時過火，蓋上蓋，放在CO2孵箱。24小時后觀察是否貼壁。（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液時每孔加1~1.5ml）

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