CRISPR KI(Tag)
產品名稱： CRISPR KI(Tag)
英文名稱： CRISPR KI(Tag)
產品編號： IC4
產品價格： 詢價
產品產地：
品牌商標： null
更新時間： 2025-08-15T14:27:06
使用范圍： null
啟東芳景生物科技有限公司
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CRISPR KI(Tag)
通過CRISPR和donor質粒(同源臂+插入序列)的共同作用，實現對靶點進行切割的同時，通過HR介導的同源重組修復方式，精確插入外源序列的目的。多適用于內源基因N或C端插入標簽基因(Tag)，以分析和獲取該基因的表達模式。
提供兩種技術方案，根據有無篩選標記(marker)區分：
| 無marker | 有marker | |
| 獲得陽性方式 | 分子鑒定 | 表型篩選(眼睛的RFP) |
| 效率 | 略高 | 略低 |
| 篩選陽性通量 | 大部分F1代 | 全部F1代 |
| 成功率 | 較高 | 較高 |
| 編輯后序列 | 精確，無多余序列 | 移除后殘留34bp的loxP |
| 周期 | 短 | 長(需要marker移除) |
| 價格 | 相對高(分子鑒定成本高) | 相對低(陽性篩選方便) |
| 適用范圍 | 廣泛 | 僅針對C端插入 |
| CRISPR KI-tag(with marker) | ||
| 實驗步驟 | 內容 | 周期(周) |
| target測序 | 1.方法：PCR測序 2.目的：確定注射果蠅品系的靶序列，確保gRNA序列正確并進行有效切割 |
1 |
| gRNA和cas9-mRNA合成制備 | 1.gRNA設計：一個靶位點設計兩個gRNA 2.gRNA合成：T7體外轉錄合成 3.cas9-mRNA合成：優化的cas9-DNA質粒為模板，體外轉錄合成cas9-mRNA |
0 |
| donor質粒載體構建 | 1.arm載體構建：無縫克隆連接 載體：Amp抗性常規載體 片段：注射果蠅基因組DNA中克隆5'+3'同源臂 2.Donor載體構建：無縫克隆連接 載體：arm載體PCR線性化，并在gRNA識別位置引入點突變 片段：插入序列 + loxP-3P3-RFP-loxP marker(LRL) 3.Donor質粒去內毒素提取 |
3~4 |
| 顯微注射 | 1.注射品系：w1118(或客戶指定品系) 2.注射樣品：gRNA+cas9-mRNA+donor 3.注射胚胎數量：400-500個 |
2 |
| 雜交和篩選 | 1.P0果蠅與平衡子雜交 2.篩選F1陽性果蠅(3P3-RFP) |
2 |
| 分子鑒定 | 插入序列和基因組插入位置PCR和測序鑒定 | 0 |
| marker移除和構建穩定品系 | 1.F1陽性果蠅雜交平衡子 2.構建RFP穩定/純合品系 3.F2果蠅與CRE內源表達品系雜交 4.子代F3挑選無RFP果蠅雜交平衡子，并進行PCR和測序鑒定確保RFP移除 5.構建marker移除的穩定/純合品系 |
10~12 |
| 合計 | 18~21 |
| CRISPR KI-tag(without marker) | ||
| 實驗步驟 | 內容 | 周期(周) |
| target測序 | 1.方法：PCR測序 2.目的：確定注射果蠅品系的靶序列，確保gRNA序列正確并進行有效切割 |
1 |
| gRNA和cas9-mRNA合成制備 | 1.gRNA設計：一個靶位點設計兩個gRNA 2.gRNA合成：T7體外轉錄合成 3.cas9-mRNA合成：優化的cas9-DNA質粒為模板，體外轉錄合成cas9-mRNA |
0 |
| donor質粒載體構建 | 1.arm載體構建：無縫克隆連接 載體：Amp抗性常規載體 片段：注射果蠅基因組DNA中克隆5'+3'同源臂 2.Donor載體構建：無縫克隆連接 載體：arm載體PCR線性化，并在gRNA識別位置引入點突變 片段：插入序列 3.Donor質粒去內毒素提取 |
3~4 |
| 顯微注射 | 1.注射品系：w1118(或客戶指定品系) 2.注射樣品：gRNA+cas9-mRNA+donor 3.注射胚胎數量：400-500個 |
2 |
| 雜交鑒定和構建穩定品系 | 1.P0果蠅與平衡子雜交，并進行插入序列和基因組插入位置PCR鑒定 2.陽性P0的子代F1果蠅與平衡子雜交，并進行插入序列和基因組插入位置PCR和測序鑒定 3.陽性F1的子代F2果蠅與平衡子雜交，并進行插入序列和基因組插入位置PCR鑒定 4.陽性F2的子代F3果蠅自交構建穩定/純合品系 |
8~10 |
| 合計 | 14~17 |