GUIDE-Pro體內(nèi)脫靶檢測及高通量篩選有效sgRNA

自2013年初發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9在細胞內(nèi)實現(xiàn)DNA精確編輯開始，該技術(shù)近年呈井噴式發(fā)展。相對于ZFN、TALEN等基因編輯技術(shù)來說，其更加簡單、經(jīng)濟、容易操作，一般的實驗室都可以構(gòu)建自己的平臺。令其成為迄今為止最為有效、低廉和容易的基因編輯方法。但目前CRISPR/Cas9的應用主要面臨兩大問題：其一是存在脫靶效應，嚴重影響了其臨床應用；其二是sgRNA設計軟件種類繁多，各有優(yōu)劣。軟件設計出的sgRNA需要進一步進行實驗篩選，浪費了大量時間和金錢。

基于此，我們開發(fā)了一種高通量的、高敏感性和特異性的、同時檢測切割效率和脫靶效應的有效sgRNA篩選方法——GUIDE-Pro。是基因編輯研究中不可或缺的脫靶檢測方法，也是廣大科研人員進行sgRNA篩選的利器。

脫靶檢測原理及實驗流程

舒桐升級版GUIDE-?Pro優(yōu)勢

1. 直接在活細胞體內(nèi)進行檢測，切割效率和脫靶效應更加符合實際；
2. 更高的敏感性及特異性；
3. 更高的性價比：常用于基因編輯實驗中有效sgRNA的篩選，同時獲得不同sgRNA的在靶和脫靶數(shù)據(jù)，為后續(xù)實驗提供有效支撐，大大降低后續(xù)實驗及時間成本;
4. 更高的靈活性：除了CRISPR/Cas9，同時我們也成功開發(fā)了針對TALEN及ZFN的脫靶檢測技術(shù)及分析流程；
5. 更短的服務周期：從準備細胞到最終可視化結(jié)果呈現(xiàn)，僅需半月。

舒桐升級版GUIDE-Pro的應用場景

1. ?設計多條sgRNA后，利用GUIDE-Pro篩選切割效果最高，或者脫靶最低的sgRNA；無需再進行傳統(tǒng)的耗時耗力的低通量篩選驗證；
2. ?針對前期實驗已經(jīng)獲得的有切割能力的sgRNA，需要進一步明確其體內(nèi)脫靶效應；
3. 基因編輯治療過程中治療效果及脫靶效應的檢測。

實驗示例：GUIDE-Pro VS. GUIDE-seq

1. 我們通過檢測相同位點在相同數(shù)據(jù)量條件下的脫靶，結(jié)果顯示：升級版GUIDE-seq的在靶reads數(shù)更高（≥1倍），脫靶reads數(shù)也提高了≥4倍。更為重要的是，GUIDE-Pro可以找到更多的脫靶位點。大大的提高了脫靶檢測的敏感性和特異性。
2. 相較于傳統(tǒng)GUIDE-seq，本公司研發(fā)的GUIDE-Pro技術(shù)性價比極高。常用于基因編輯實驗中有效sgRNA的篩選，同時獲得不同sgRNA的在靶和脫靶數(shù)據(jù)。為后續(xù)實驗提供有效支撐，大大降低后續(xù)實驗及時間成本。

3. 成功開發(fā)了TALEN及ZFN脫靶檢測流程：目前全國乃至全世界均無有效的檢測TALEN及ZFN基因編輯方法的檢測手段，我們通過對實驗及分析流程的不斷改進，成功開發(fā)了針對TALEN及ZFN的檢測方法。

服務內(nèi)容

樣品要求

1. 可提供目標基因序列，由我公司免費設計sgRNA；
2. 或由客戶僅需提供sgRNA序列，由我公司構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒。或者提供sgRNA質(zhì)粒即可，由我公司進行轉(zhuǎn)染及后續(xù)建庫測序；實驗用細胞系由客戶提供；
3. 若提供電轉(zhuǎn)后的DNA，則需要DNA樣品總量：5ug以上，濃度50ng/ul以上。DNA樣品純度：OD260/280=1.8~2.0 。DNA樣品完整性：DNA無明顯降解，需提供凝膠電泳檢測膠圖。
4. 客戶需檢測ODN是否插入，若需我公司完成則需提供靶點信息。

參考文獻

1. Ling, X. et al. Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a-based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates. Mol Cell 81, 4747-4756 e4747, doi:10.1016/j.molcel.2021.09.021 (2021).
2. Cui, Z. et al. The comparison of ZFNs, TALENs, and SpCas9 by GUIDE-seq in HPV-targeted gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids 26, 1466-1478, doi:10.1016/j.omtn.2021.08.008 (2021).
3. Fan, W. et al. Non-homologous dsODN increases the mutagenic effects of CRISPR-Cas9 to disrupt oncogene E7 in HPV positive cells. Cancer Gene Ther, doi:10.1038/s41417-021-00355-z (2021).