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干細(xì)胞（Stem cell）即起源細(xì)胞。在細(xì)胞的分化過程中，細(xì)胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。機(jī)體在發(fā)展適應(yīng)過程中為了彌補(bǔ)這一不足，保留了一部分未分化的原始細(xì)胞。因此，干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。

能自我更新和分化

具自我復(fù)制的能力

能在一定條件下分化成具有特定形態(tài)和功能的成熟細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞

從囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)獲得 胚胎生殖細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞都可自發(fā)分化形成三胚層的全部細(xì)胞。

成體干細(xì)胞

特定的組織中能自我更新并分化成相應(yīng)組織內(nèi)具有特定功能的成熟細(xì)胞可塑。

一、培養(yǎng)條件

1. 環(huán)境：細(xì)胞培養(yǎng)需要一個(gè)無菌的環(huán)境，所以盡量是在一個(gè)獨(dú)立的房間里進(jìn)行。要求配有空氣凈化系統(tǒng)， 能夠?qū)φ麄€(gè)房間進(jìn)行殺菌的紫外燈

2. 設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、冰箱、水浴鍋、離心機(jī)、實(shí)驗(yàn)桌、移液器等。

3. 實(shí)驗(yàn)耗材：一次性的細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶、15ml或50ml離心管、脫脂棉花、封口膜等。

4. 試剤：干細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件要求較高，可以根據(jù)自己的條件，盡量選用質(zhì)量好的各種試剤。

試剤的配制：

① DMEM培養(yǎng)基：去離子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3

② MEF培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基中含10%FBS, 1000u/ml青莓素,1000g/ml鏈霉素

③ ES培養(yǎng)基：ES培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基中含15% FBS, 1000u/ml青莓素，1000g/ml鏈霉素，1mM丙桐酸 鈉，0.1mM非必須氨基酸，2mM谷氨酰胺，0.1mM筑基乙醇，1000u/ml白血病抑制因子

④ D-Hank's： 0.8%NaCI，0.04%KCI， 0.035%NaHC03， 0.006%KH2P04，0.005325%Na2HP04, 0.001% 酚紅

⑤ 0.1%明膠：D-HanK's溶液中含0.1%的明膠

⑥ ES細(xì)胞凍存酒：90% ES培養(yǎng)基，10% DMSO

⑦ MEF細(xì)胞凍存酒：90% MEF培養(yǎng)基，10% DMSO

⑧ Feeder 細(xì)胞凍存酒：90% FBS , 10% DMSO

⑨ 絲裂莓素C：根據(jù)產(chǎn)品說明書來配制二、

培養(yǎng)步驟

常見的干細(xì)胞培養(yǎng)是勝胎干細(xì)胞（ES cells）培養(yǎng)。我們以小鼠的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)為例。

1. 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts, MEF）的復(fù)蘇胚胎干細(xì)胞一般是在37℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下，生長在鋪有一層滋養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)皿或者是細(xì)胞培養(yǎng)瓶中（此處以細(xì)胞培養(yǎng)皿為例）。因此要先鋪?zhàn)甜B(yǎng)層細(xì)胞。

① 在37P水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。

② 把融化的細(xì)胞懸浮酒加到裝有幾毫升預(yù)熱好的MEF培養(yǎng)基的無菌離心管中，輕輕混勻后,1000xg , 5min離心收集細(xì)胞。

③ 吸掉上清（除去凍存酒中的DMSO）,用10ml預(yù)熱的MEF培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，加到一個(gè)10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿 中，放入37℃，含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

④ 根據(jù)情況對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，大約4天左右，細(xì)胞就可以基本長滴整個(gè)培養(yǎng)皿，這時(shí)可以進(jìn)行傳代、凍存 或用于制備滋養(yǎng)細(xì)胞層。

2. 滋養(yǎng)細(xì)胞層（feeder cells layer）的制備

① 把長好的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基吸掉，加入10ml新鮮的MEF培養(yǎng)基，并在避光的條件下加入 110μL 配好的絲裂莓素C,混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h。 ② 把含有絲裂莓素C的培養(yǎng)基用無菌的15ml離心管收集起來避光保存，在一周之內(nèi)可再次使用（直接使 用該培 養(yǎng)基處理細(xì)胞5hh。用PBS（不含二價(jià)離子）洗滌細(xì)胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化細(xì)胞，37°C培 養(yǎng)箱放置約3min,直到細(xì)胞懸浮起來。

③用1ml MEF培養(yǎng)基中和胰酶的作用，之后把細(xì)胞收集到離心管里，1000xg離心5min。

④ 去掉上清，用1ml MEF培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，之后把細(xì)胞平均分到兩個(gè)經(jīng)過0.1 %明膠處理過的細(xì)胞培養(yǎng)皿 中，用MEF培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。（明膠處理：加5ml 0.1%的明膠到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37°C培養(yǎng)箱中至少 放 10min,之后把明膠吸掉即可）

⑤ 一般處理好的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在1~2h之后即可以貼壁，形成滋養(yǎng)細(xì)胞層，這時(shí)的滋養(yǎng)細(xì)胞層即可 用來 培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞。制備好的滋養(yǎng)細(xì)胞層可以在MEF培養(yǎng)基中保持1周左右的時(shí)間，或者是把細(xì)胞凍存。

3. 小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cells, ES cells）的復(fù)蘇

① 在37℃水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎干細(xì)胞。

② 把融化的細(xì)胞懸浮酒加到裝有幾毫升預(yù)熱好的ES培養(yǎng)基的無菌離心管中,輕輕混勻后,1000xg , 5min 離心收集細(xì)胞。

③ 吸掉上清（除去凍存酒中的DMSO,用10ml預(yù)熱的ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，加到一個(gè)10cm的鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37°C,含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

④ 根據(jù)情況對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，大約3~4天左右，細(xì)胞就可以基本長滴整個(gè)培養(yǎng)皿，這時(shí)可以進(jìn)行傳代、凍存或用于后續(xù)試驗(yàn)。

4. 小鼠胚胎干細(xì)胞的傳代

① 吸掉培養(yǎng)基，用PBS（不含二價(jià)離子）洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱放置約 5min，直到細(xì)胞基本懸浮起來。

② 用1ml ES培養(yǎng)基中和胰酶的作用，之后把細(xì)胞收集到離心管里，1000xg離心5min。

③ 去掉上清，用幾毫升ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，之后根據(jù)培養(yǎng)皿規(guī)格和分配比，把細(xì)胞按一定比例分到鋪有 滋養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加ES培養(yǎng)基培養(yǎng)。ES細(xì)胞的分配比可以是1：1到1：10。

5. 小鼠胚胎干細(xì)胞的凍存

① 吸掉培養(yǎng)基，用PBS（不含二價(jià)離子）洗2-3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化細(xì)胞37°C培養(yǎng)箱放置約5min，直到細(xì)胞基本 懸浮起來

② 用1ml ES培養(yǎng)基中和胰酶的作用，之后把細(xì)胞收集到離心管里，1000xg離心5min。

③ 去掉上清，用預(yù)先配制好的預(yù)冷的ES細(xì)胞凍存液來重懸細(xì)胞（凍存液的量視凍存的細(xì)胞量來定，一般 一個(gè)長滿的10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿可以凍存4~6管）,按每管1 ml的量分裝到凍存管中。梯度降溫：4°C20min, -20°C20min, -80°C過夜后迅速轉(zhuǎn)入液氮中。

二、注意事項(xiàng)

1. 絲裂莓素C在操作時(shí)要避光，避免其分解。

2. ES細(xì)胞傾向于聚集生長，因此在復(fù)蘇時(shí)，要選擇好培養(yǎng)皿的規(guī)格。

3. ES細(xì)胞不能長的太滿，應(yīng)避免使各個(gè)克隆之間接觸，以免發(fā)上分化。

4. 為避免水或血清帯來的污染，對(duì)血清應(yīng)進(jìn)行支原體檢測，配好的培養(yǎng)基要進(jìn)行污染測試。