Western Blot
產品名稱： Western Blot
英文名稱： Western Blot
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?Western blot檢測方法
1)??????????????制膠：灌制10%分離膠和5%濃縮膠。待濃縮膠凝固后，小心地拔出梳子，移入電泳槽，加電泳緩沖液。
2)??????????????上樣：各組樣品加上樣緩沖液并經99℃變性5 min，短暫離心后上樣。樣品上樣量約50?μg，預染蛋白Marker上樣量為5 μl。
3)??????????????電泳：將電泳槽與電源連接，起始電壓80 V，待染料前緣進入分離膠后調電壓至120 V。繼續電泳至溴酚藍到達分離膠底部。
4)??????????????電轉：電泳結束后，準備轉膜。剪6張濾紙和1張PVDF膜，其大小、形狀與凝膠一致。PVDF膜先在甲醇中浸泡激活約20 sec，然后與濾紙一起放入電轉液中平衡10 min。打開凝膠夾，以黑色板為陰極，從黑色板向上依次放入海綿、3張濾紙、凝膠、PVDF膜、3張濾紙、海綿。除去氣泡夾緊凝膠夾，放入轉移槽中，黑色板對準陰極，安裝好轉移裝置，加入電轉液，200 mA恒定電流，轉移1-2 h。
5)??????????????封閉：電轉結束后，把PVDF膜取出，浸泡在5%脫脂奶粉中，室溫封閉1 h。
6)??????????????一抗孵育：用1%BSA按最佳比例稀釋一抗，4℃孵育過夜。抗體稀釋度分別為KCa1.1 (1:500)、?Homer 1a (1:500)、Homer 1b/c (1:2000)、β-Actin (1:10000)。
7)??????????????洗滌：TBS-T洗滌3次，每次10 min。
8)?????????????二抗孵育：用1%BSA稀釋HRP標記的二抗（山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG稀釋度均為1:10000，驢抗羊IgG稀釋度為1:5000），與PVDF膜在室溫下孵育約1 h。
9)??????????????洗滌：TBS-T洗滌3次，每次10 min。
10)??????????ECL法顯色（暗室操作）：
l??????配制ECL工作液：取等體積的A液和B液混合，放置使之升到室溫。
l??????將PVDF膜與工作液充分接觸，室溫孵育3 min。
l??????曝光：暗盒中鋪一張保鮮膜，將PVDF膜去盡殘液，貼在保鮮膜上，然后再覆蓋一層保鮮膜。黑暗中放入X光膠片，壓在包好的膜上。關上暗盒，開始計時，根據信號強弱適當調整曝光時間，一般為1～5 min。
l??????顯影，定影：曝光完成后，打開暗盒，取出X光膠片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶后，即刻終止顯影。將X光膠片在水中沖洗一下，去掉顯影液，然后浸入定影液中，定影時間一般為5~10 min，用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。
