Taqman探針合成
產(chǎn)品名稱： Taqman探針合成
英文名稱： Taqman Taqman-MGB
產(chǎn)品編號： rc-7
產(chǎn)品價格： 0
產(chǎn)品產(chǎn)地： null
品牌商標： null
更新時間： 2023-09-21T16:12:32
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1，合成原理
??? DNA通過固相亞磷酰胺三酯法合成：溶液中的亞磷酰胺單體通過縮合反應形成3′--5′磷酸二酯鍵，連接到固相載體（CPG或樹脂）上。并依次延伸，直到序列的最后一個5′堿基連接上后合成結束。整個合成過程儀器自動完成，每個循環(huán)分為脫保護、活化、偶合、蓋帽（封閉）、氧化五個步驟。
??? 第一步：脫保護（Deblocking）:用三氯乙酸（TCA）去除CPG所鏈核苷上的DMT保護基團，暴露5′羥基，供下一步縮合。??? 第二步：活化（Activation）:單體與催化劑四唑混合進入合成柱，四唑轉移一個質子給3′亞磷酸上二異丙胺基的N原子，質子化的氨是四唑親核進攻的離去基團，二異丙酰胺被四唑取代，形成亞磷酰胺-四唑活性中間體。
??? 第三步：偶合（Coupling）:亞磷酰胺-四唑中間體與CPG所連接的核苷酸的5′羥基發(fā)生縮合反應，縮合脫掉四唑，形成延長一個堿基的核苷酸鏈。
????第四步：蓋帽（Capping）:少量未反應（2%）的載體上的核苷酸鏈的5′羥基會在后續(xù)的循環(huán)中參加反應，生成少一個堿基的核苷酸鏈，因此需要在反應后進行封閉。常用乙?；磻c5′羥基縮合成酯鍵，一般用混合乙酸酐和N-甲基咪唑等做乙?；噭?。????第五步：氧化（Oxidation）:偶合反應形成的三價亞磷酸酯鍵很不穩(wěn)定，因此要用氧化劑——碘的四氫呋喃溶液將三價磷氧化成穩(wěn)定的五價磷。依此步驟循環(huán)，最終得到一個全長DNA粗品 。
??? 探針合成需要在3末端任意加一個堿基，合成結束后根據(jù)不同標記連接不同試劑。
??? 用新鮮的濃氨水把粗品從載體上切割下來，采用適當?shù)募兓绞饺コ唐魏桶被摫Ｗo及乙基脫保護形成的鹽離子。
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?2，純化原理 ?? 目前慣用的純化方式主要有4種： OPC純化、 PAGE 純化、脫鹽純化、 HPLC純化，洛成除特別要求，一般都采用PAGE 純化
??? 利用DNA不同片段在膠中遷移率不同而分離，大片段電荷多，分子大，遷移的速度慢。等目的片段與N-片段分開后切下目的片段，80℃孵育2小時后脫鹽。
??? 優(yōu)點：分離效果好，純度能達到98-99%，可以滿足測序、克隆等用。引物也很穩(wěn)定。
??? 缺點：比較費時費力，樣品損失很大。
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3， Taqman-MGB探針一般用于SNP檢測，也用于Realtime-PCR檢測，較普通Taqman探針可以使探針的長度縮短，?提高配對與非配對模板間的Tm值差異，信噪比更高；?