黄色在线免费观看网站,精品无码久久久久久国产潘金莲,日本欧美在线观看色,女女同性女同一区二区三区91,国产精品 欧美最新,在线视频日本不卡免费,国产av蜜臀一区二区三区野战,三级全黄做爰在线播放,最新加勒比av网址

細胞生物學技術服務

本公司為您提供最優質的細胞生物學技術服務，主要包括穩轉細胞株的構建、原代細胞分離、細胞增殖與毒性實驗、細胞周期及凋亡檢測及其他各種細胞功能學實驗。

細胞培養及篩選

細胞培養又稱細胞克隆技術，是進行所有后續細胞功能學實驗的基礎，而且通過細胞培養得到大量的細胞或其代謝產物。很多生物產品都是從細胞得來，因此，細胞培養技術是生物技術中最核心、最基礎的技術。

原代細胞的分離及培養

人或動物體內（或胚胎組織）由于多種細胞結合緊密，不利于各個細胞在體外培養中生長繁殖，即使采用1mm³的組織塊，也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長，若需獲取大量細胞，必須將現有的組織塊充分散開，使細胞解離出來，常采用的方法如下：
1. 懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當延長離心時間，但速度不能太高，延時也不能太長，以避免擠壓或機械損傷細胞。
2. 實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。
1）機械分散法
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細胞或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內（用九號針），使細胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網內用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細胞從網孔中壓擠出。
2）消化分離法
組織消化法是把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長。
原代細胞保持原有細胞的基本性質，是研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，為傳代培養創造條件并且能用于藥物篩選等。

小鼠肝實質細胞

大鼠心肌細胞

穩轉細胞株的構建

外源基因在細胞中的表達可分為兩大類，一類是瞬時表達，一類是穩定表達（永久表達）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達到高水平的表達，但通常只持續幾天，而后者外源DNA整合到宿主細胞染色體上，使宿主細胞可長期表達目的基因，穩轉細胞系的構建即為后者。建立穩定細胞株，一般是根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物對靶細胞進行篩選。最常用的抗性標記基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin進行選擇性篩選。

穩定表達細胞株在細胞中能持續穩定表達特定基因或干擾特定基因表達。目的基因質粒DNA整合到細胞染色體上，使細胞長期穩定表達該基因。穩定表達細胞株彌補了瞬時感染（或轉染）一些功能實驗中由于外源基因表達時間短的缺陷，便于長期觀察基因對于細胞功能的影響以及蛋白間相互作用。

神經元細胞（慢病毒感染后5d）

SP1/0細胞（慢病毒感染后48hr）

細胞增殖與毒性

CCK-8檢測

實驗原理
Cell Counting Kit簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8（化學名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8在電子耦合試劑存在的情況下可以被線粒體內的脫氫酶還原成高度水溶性的黃色甲臜產物。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值，間接反映活細胞數量。

技術應用
CCK-8用途非常廣泛，適合于高通量藥物篩選，應用于細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。

實驗流程

實驗結果

CKK-8檢測HO-8910PM細胞增殖抑制結構統計圖

MTS細胞增殖實驗

實驗原理
CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(a)是一種用比色法來檢測細胞增殖和細胞 毒實驗中的活細胞數量的檢測試劑。此試劑含有一個新型的四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS(a)] 和一種電子偶聯劑(phenazine ethosulfate; PES)。PES具有增強的化學穩定性，這使它可與MTS混合形成穩 定的溶液。這種方便的“單溶液”模式，是在第一代CellTiter 96?AQueous Assay的基礎上的改進，CellTiter 96?AQueous Assay中使用的電子偶聯劑PMS與MTS溶液是分開提供的。
MTS (Owen’s reagent) 被細胞生物還原成為一種有色的甲臜產物，可直接溶解于培養基中。 這種轉化很可能是在代謝活躍的細胞中的脫氫酶產生的NADPH或NADH的作用下完成的。檢測時，只需將少量的CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent 直接加入培養板孔的培養基中，孵育1–4小時，然后以酶標儀讀取490nm的吸光度值。

MTS四唑鹽和其甲臜產物的結構

實驗流程
將試劑平衡至室溫，每100ul培養基中加入20ul CellTiter 96^? AQueous One Solution Reagent，37℃孵育1-4小時，酶標儀490nm讀取吸光值。

實驗結果

CellTiter 96? AQueous One Solution Assay檢測490nm處細胞數對吸光值的影響

MTT檢測

實驗原理
MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。

技術應用
MTT法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測，大規模抗腫瘤藥物的篩選，細胞毒性實驗以及腫瘤放射敏感性測定等。

實驗流程

實驗結果

Flutamide（FLU） 和CI-1040對腫瘤細胞活性的影響
（A）5～30μM濃度范圍的FLU作用于MDA-MB-453細胞MTT檢測結果（B）2～25μM 濃度范圍的CI-1040作用于MDA-MB-453細胞MTT檢測結果

細胞周期與凋亡檢測

流式細胞術檢測細胞凋亡

實驗原理
細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，受內在遺傳機制的控制自動結束生命的過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布于細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由脂質膜內側翻向外側。Annexin V是一種廣泛分布于真核細胞胞漿的鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，與PS有很強的親和力，故可結合凋亡早期細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸。常用熒光探針FITC標記Annexin V，通過流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現紅色熒光。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以定量檢測處于的不同凋亡時期細胞。

技術應用
細胞凋亡一直是人們研究的熱點，細胞凋亡與臨床病毒有密切的關系，這種關系不僅表現在凋亡及其機制的研究，闡明了一大類免疫病的發病機制，而且由此可以導致疾病新療法的出現，通過檢測藥物、基因、或蛋白對細胞凋亡機凋亡調控基因的影響，研究腫瘤防治、老年癡呆、艾滋病、自身免疫疾病、心肌梗塞等疾病的療法。

實驗流程

實驗結果

B3作用于MCF-7細胞流式細胞儀凋亡檢測分析

流式細胞術檢測細胞周期

實驗原理
細胞周期是細胞生命活動中一個最重要的過程，細胞增殖的過程稱為細胞周期。在細胞周期中，最主要的是遺傳信息的載體DNA復制成兩份拷貝，并通過有絲分裂的方式將兩份拷貝分配到兩個子細胞內，由此，細胞周期分為DNA合成期（S期）和有絲分裂期（M期），M期結束后和S期開始前的間隙期稱為G1期，S期結束后和M期開始前的間隙稱為G2期。每一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束，構成一個完整的細胞周期。正常細胞在G1期具有二倍體細胞的DNA含量（2N），G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。碘化丙錠（PI）可以與細胞內DNA和RNA結合，采用RNA酶將RNA消化后，通過流式細胞儀檢測PI的熒光強度就可以直接反映出細胞內DNA含量。將細胞周期各時相區分為G0/G1期，S期和G2/M期，通過相關軟件進行積分便可計算出各時相的百分率。

技術應用
利用流式細胞儀進行細胞周期和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷；檢測藥物、蛋白、基因對細胞周期的影響。

實驗流程

實驗結果

流式細胞儀檢測細胞周期結果圖

細胞功能學實驗

細胞侵襲和遷移實驗

實驗原理
細胞遷移，指的是細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的濃度梯度后而產生的移動。移動過程中，細胞不斷重復著向前方伸出突觸/偽足，然后牽拉后方胞體的循環過程。細胞骨架和其結合蛋白，還有細胞間質是這個過程的物質基礎，另外還有多種物質會對之進行精密調。細胞體外遷移實驗通常用transwell實驗。常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。
細胞侵襲主要指惡性細胞從原組織脫離，侵犯到臨近正常組織的過程。鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養液或人睪丸上皮成纖維細胞培養液，上室加入重懸的瘤細胞，具有侵襲能力的細胞在趨化劑誘導下開始穿膜運動。

技術應用
細胞遷移，涉及細胞覓食、傷口痊愈、胚胎發生、免疫反應、感染和癌癥轉移等等生理現象，是目前細胞生物學研究的一個主要課題，科學家們試圖通過對細胞遷移的研究，在阻止癌癥轉移、異體植皮等醫學應用方面取得更大成果。細胞體外侵襲實驗主要應用于各種細胞因子對惡性腫瘤細胞侵襲和轉移的影響及一些抑制血管生成的新藥研究。

實驗流程

實驗結果

細胞遷移實驗

免疫熒光實驗

實驗原理
細胞免疫化學與免疫組織化學實驗都是依據抗原抗體反應和化學顯色的原理，采用標記的特異性抗體對組織或細胞內抗原的分布進行原位檢測技術。免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。細胞免疫化學將培養處理后的細胞爬片、固定、破膜、封閉后，加入一抗與抗原蛋白結合，再加入標記有熒光素的二抗與一抗進行反應，最后通過激光共聚焦掃描顯微鏡進行熒光拍攝來顯示細胞中靶蛋白的表達變化和定位。

技術應用
免疫熒光實驗可以特異性地檢測靶蛋白在細胞內的表達和定位。

實驗流程
細胞培養---加藥處理---細胞爬片----細胞固定、封閉----抗體孵育----熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡檢測---圖片采集、處理

實驗結果

細胞免疫熒光實驗結果圖

Western blot檢測

實驗原理
Western Blot，即蛋白質印跡法，又稱為免疫印跡法，是一種可以檢測固定在固相載體上蛋白質的免疫化學技術方法。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

技術應用
Western Blot法應用于分子生物學、生物化學和免疫遺傳學，可對目標蛋白進行定性和半定量的分析；對非放射性標記蛋白組成的復雜混合物中的某些特定蛋白質進行鑒定和定量；還可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后續分析。

實驗流程

實驗結果

KLT對異種移植瘤PI3K-AKT-mTOR信號通路的影響

TALEN技術

實驗原理
TALE (Transcription Activator-Like Effector) 是由植物致病細菌Xanthomonas分泌的一類具有轉錄激活功能的蛋白，該種蛋白通過其內部保守的重復氨基酸序列（即DNA結合域）與植物宿主基因啟動子區的相應核苷酸序列發生特異性結合，并激活基因表達。
TALE的DNA結合域由一些非常保守的重復氨基酸序列模塊組成，每個模塊一般包含33~35個氨基酸（aa），其第12,13位氨基酸種類可變且決定了TALE與DNA結合的特異性。因此稱這種重復可變的雙氨基酸序列為RVD (Repeat Variable Diresidue)。
TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 是一種人工改造的限制性內切酶，是將TALE的DNA結合域與限制性內切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA結合域中的重復氨基酸序列模塊可以與單堿基發生特異性結合，因此理論上可以任意選擇靶DNA序列進行改造，是一種非常有效的基因組改造工具酶。
TALEN在細胞中與基因組的靶位點結合，形成二聚體發揮內切酶活性，導致左右TALEN的spacer區域發生雙鏈DNA斷裂（DSB，Double-Strand Breaks），從而誘發DNA損傷修復機制。細胞可以通過非同源性末端接合機制（NHEJ, Non-homologous End Joining）修復DNA。NHEJ修復機制并不精確，極易發生錯誤（缺失/插入），從而造成移碼突變，因此可以達到基因敲除的目的。