服務(wù)流程
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服務(wù)說明
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MTT MTS CCK8
? ? ? ?反映細(xì)胞增殖情況；通常連續(xù)檢測(cè)5天，獲得細(xì)胞增殖曲線；檢測(cè)細(xì)胞增殖最經(jīng)濟(jì)常用的方法，MTT只適用于貼壁細(xì)胞，MTS/CCK8可用于懸浮細(xì)胞。
技術(shù)原理
? ?活細(xì)胞特別是增殖期細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT（即黃色噻唑蘭）還原成難溶于水的藍(lán)紫色針狀Formazan結(jié)晶并沉淀在細(xì)胞中，且Formazan的形成量與細(xì)胞活力成正比，二甲基亞砜（DMSO）能夠溶解Formazan結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，即可間接反映細(xì)胞增殖情況。MTS及WST–8（CCK-8試劑）都是新型唑類化合物，和MTT一樣，同樣都能被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原，MTS及WST–8被還原后的Formazan化合物具有高度水溶性，無需再用加DMSO，可直接用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。
? ? ? 因還原生成的甲臜物數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，MTT、MTS、CCK-8均可用于細(xì)胞增殖的檢測(cè)，目前被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。
吉?jiǎng)P應(yīng)用實(shí)例
? ? ? 為研究某基因是否是某腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的關(guān)鍵基因，可將目的基因shRNA慢病毒感染靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的目的基因表達(dá)下調(diào)，隨后用MTT進(jìn)行檢測(cè)，觀察目的基因表達(dá)下調(diào)后的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比細(xì)胞增殖的變化，從而推斷結(jié)論。
? ?用待研基因shRNA慢病毒感染A375細(xì)胞，3天后收集細(xì)胞，按2000/孔的細(xì)胞數(shù)量接種細(xì)胞至96孔板，第二天待細(xì)胞貼壁后，開始進(jìn)行MTT檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)5天，獲得細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，shRNA下調(diào)目的基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖顯著減緩，表明待研基因與A375細(xì)胞增殖顯著相關(guān)。
BrdU EdU
? ?可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入，而后利用抗BrdU單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。
技術(shù)原理
? ? ?? ?溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine, BrdU）是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，可競(jìng)爭(zhēng)性摻入S期細(xì)胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶，利用抗體連接酶或熒光素作為指示系統(tǒng)標(biāo)記BrdU，當(dāng)處于旺盛分裂的細(xì)胞摻入BrdU后，即可檢測(cè)出含有BrdU的細(xì)胞，并以此判斷細(xì)胞的數(shù)目。固相包被細(xì)胞的微孔中加入BrdU抗體，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的BrdU呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過OD值的高低，反映正在合成DNA細(xì)胞數(shù)的多少，從而反映正處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞量。
吉?jiǎng)P應(yīng)用實(shí)例
? ? ? ?用待研基因shRNA慢病毒感染T24細(xì)胞，3天后收集細(xì)胞接種96孔板，待細(xì)胞貼壁后第一天和第四天進(jìn)行Brdu檢測(cè)，結(jié)果顯示，shRNA下調(diào)目的基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖顯著減緩，表明待研基因與T24細(xì)胞增殖顯著相關(guān)。
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