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熒光差異凝膠電泳技術基本實驗線路是電泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三種熒光染料分別標記蛋白質樣品(其中包括一個蛋白質內標)。然后將標記好的蛋白質樣品混合，在同一塊膠上進行雙向電泳。電泳結果分別用3種不同的激發波長得到不同顏色的熒光信號，根據這些信號的比例來判定樣品之間蛋白質的差異，并且專用軟件可全自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。
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