第1階段  樣品制備和固定

樣品的固定是 ICC 實驗和儲存過程中維持細胞形態的重要步驟。

對于蓋玻片上培養的細胞

在此過程中，細胞在固定前直接培養在蓋玻片上。

所需材料

− 標準蓋玻片或多孔板

− 無菌PBS

− 用于包被的蛋白質（例如聚-L-賴氨酸）

− 無菌水

步驟

1. 制備包被溶液并過濾——必要時滅菌。

提示 ：不同的樣品類型可能需要不同的蛋白質來幫助粘附。典型的包被溶液是在 PBS 中添加聚-L-賴氨酸 (PLL)、聚-D-賴氨酸 (PDL) 或明膠制備而成。請參閱文獻了解您感興趣的細胞類型和推薦的包被蛋白濃度。

2. 用包被溶液覆蓋玻片或平板。

室溫下孵育時間通常為1小時至24 時。

提示： 將蓋玻片放入組織培養板的孔中，并用包被液覆蓋。

3. 用無菌 PBS沖洗蓋玻片3次。

提示： 這是為了確保去除蓋玻片上的游離蛋白質。

4. 讓蓋玻片完全干燥。如果需要，在紫外線下消毒至少4小時。

警告：或者，蓋玻片可以在包被之前用 70% 乙醇清洗，并在整個過程中使用無菌溶液。

5. 在包被的蓋玻片或平板上培養細胞。

6. 確定細胞總數并檢查細胞活力。

一般來說，存活率應為 90 - 95%。

7. 準備固定劑，并用選定的固定劑孵育細胞。

提示：乙醇、甲醇和丙酮會使細胞透化，因此使用這些固定劑前通常不需要另外透化。較長的孵育時間通常會導致較高程度的固定，直至表位可能過度固定。孵育時間短可能會導致表位保存不良和樣品固定不足。最佳固定時間需要憑經驗確定。

8. 用洗滌緩沖液清洗細胞 3 次。

提示：理想情況下，固定后盡快進行染色。但樣品可以保存在 0.1% 疊氮化鈉/PBS 中，在 4°C下保存 1-2 周。較長的儲存時間可能會緩慢地逆轉固定，導致形態較差和表位保存不良。

對于懸浮細胞

對于懸浮細胞，可以在將懸浮液培養到載玻片上之前洗滌并固定細胞。

所需材料

− 細胞懸液

− 聚苯乙烯圓底 12 × 75 mm 2 個Falcon 管/96 孔板（或任何與您的離心機兼容的容器）

− 懸浮液/洗滌緩沖液（例如PBS）

步驟

1. 根據廠商的指導收獲和洗滌細胞。

2. 確定細胞總數，并檢查細胞活力。

一般來說，存活率應為90 - 95%。

3. 離心，并在冰冷的懸浮緩沖液中重懸細胞樣品。

3.1. 在4°C下以約 200 xg 離心5分鐘。

提示：旋轉時間和速度可能需要優化。

4. 準備固定劑，并用選定的固定劑孵育細胞。

提示：乙醇、甲醇和丙酮會使細胞透化，因此使用這些固定劑前通常不需要另外透化。較長的孵育時間通常會導致較高程度的固定，直至表位可能過度固定。孵育時間短可能會導致表位保存不良和樣品固定不足。最佳固定時間需要根據經驗確定。

5. 用洗滌緩沖液清洗細胞3次。

5.1. 將細胞離心成沉淀（200 xg，5分鐘，4°C）。

5.2. 每次洗滌后去除上清液并重新懸浮沉淀。

提示：理想情況下，固定后盡快進行染色。但樣品可以保存在 0.1% 疊氮化鈉/PBS 中，在4°C下保存 1-2 周。較長的儲存時間可能會緩慢地逆轉固定，導致形態較差和表位保存不良。

6. 將約10 µL懸浮細胞移至載玻片上。

使用的最佳細胞密度取決于所使用的細胞系和實驗要求。

此時的典型密度為 10 6 - 10 7 個細胞/mL。

第 2 階段  透化（可選）

透化作用將部分溶解細胞膜，使抗體能夠到達細胞內表位。如果 PFA 用作固定劑，則尤其需要這樣做。甲醇等有機溶劑通常會同時透化和固定細胞，因此使用有機溶劑作為固定劑時并不嚴格要求透化。

所需材料

− 經過相關固定步驟的樣品

− PBS

− 洗滌劑（見表1）

− 疏水屏障筆（可選）

步驟

所需時間約20分鐘。

1. 根據以下步驟，用 PBS 稀釋洗滌劑來制備透化溶液：

表 1：透化用洗滌劑

警告： Triton X-100 是最常用的用于提高抗體滲透性的去污劑。然而，它通常不太適合膜相關抗原，因為它溶解膜及其相關蛋白。最佳的去垢劑取決于蛋白質及其定位。

應針對所使用的樣品優化去污劑的濃度和孵育時間。

如果樣品在載玻片上，您可以用PAP筆圈出細胞樣品，以幫助匯集試劑。

2. 用透化溶液覆蓋細胞并在室溫下孵育 2-5 分鐘。

提示：如果樣品位于載玻片上，您可以用 PAP筆圈出細胞樣品，以幫助匯集試劑。

3. 用 PBS 洗滌細胞 3 次。

第三階段  封閉

在 ICC 中，封閉步驟對于防止圖像中的高背景染色特別重要。典型的封閉劑是與二抗宿主物種或BSA相對應的2-10%血清蛋白溶液，其物種依賴性較小，但封閉效率可能較低。封閉液不應含有一抗宿主動物的血清，因為這可能會導致高背景。

所需材料

− 已經歷相關固定和透化步驟的樣品

− 蛋白封閉劑

− 二抗宿主物種的正常血清

− 牛血清白蛋白（例如，B265991）

− PBS（例如P492453）

− 甘氨酸

步驟

所需時間約2小時。

1. 準備封閉緩沖液。

1.1. 將所選的蛋白質封閉劑溶解在PBS中至2-10 % w/v。

1.2. 加入濃度為0.1 M的甘氨酸（可選）。

2. 通過在封閉緩沖液中孵育細胞來封閉細胞。

室溫孵育1-2 h

警告：如果樣品位于載玻片上，您可以用PAP筆圈出細胞樣品，以幫助匯集試劑。

3. 繼續抗體孵育。

第4階段  抗體孵化

執行必要的封閉步驟后，您現在就可以用抗體對細胞進行染色了。通常有兩個原則：(i) 直接 ICC，其中一抗直接與熒光團綴合，以及 (ii) 間接 ICC，其中使用合適的熒光標記二抗檢測一抗。兩種方法都有優點和缺點，這里將更詳細地討論。間接 ICC 是最常用的協議。

多色 ICC 涉及使用兩組或多組抗體對細胞進行染色，以揭示兩種或多種感興趣蛋白質的分布或共定位。下面給出的間接和直接協議均可適用于多色 ICC。如果間接 ICC 用于多色，強烈建議使用預吸附二抗。這些抗體針對其他物種進行了預吸附，從而最大限度地減少了所用二抗與來自不同物種的一抗發生交叉反應的機會。

間接法

所需材料

− 已經歷相關透化/封閉步驟的細胞

− 抗體稀釋緩沖液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含有 0.1% Tween-20 的 PBS，例如 T434505、P196391）

− 洗滌緩沖液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含 0.1% Tween-20 的 PBS，例如T434505、P196391）

− 一抗

− 偶聯二抗

− 疏水性屏障筆——可選用于載玻片或蓋玻片上的小細胞體積

步驟

所需時間約13小時30分鐘。

1. 確定要使用的最佳抗體稀釋度。然后用抗體稀釋緩沖液稀釋抗體。

抗體數據表上通常會建議最佳稀釋度。

警告：您應該進行稀釋以確定最有效的抗體濃度。

抗體稀釋緩沖液可以僅為PBS。稀釋緩沖液還可能含有 0.1% Tween（以降低表面張力）和 1% BSA（作為額外的封閉劑以減少非特異性結合）。

2. 將樣品在預稀釋的一抗中孵育。

室溫孵育 2 小時，或4°C過夜

警告：孵育時間和溫度可能需要優化。

提示 1：抗體溶液需要完全覆蓋您的樣品。

提示 2：使用疏水性屏障筆有助于容納小體積。

3. 用 PBS 或 PBS-T 清洗載玻片3次。

4. 在抗體稀釋緩沖液中制備二抗，并將樣品浸入預稀釋的二抗中。

室溫孵育1小時。

提示 ：可能需要優化孵育時間和抗體濃度。典型的二抗稀釋度為 1:1000 或 1:2000 或 0.1-2 µg/mL。對于多色實驗，通常可以稀釋不同的二抗并一起孵育。如果使用熒光團，則必須在黑暗中孵育以避免光漂白。

5. 用 PBS 或 PBS-T 清洗樣品 3 次。

6. 繼續復染、封片和成像。

直接法

所需材料

− 已經歷相關透化/封閉步驟的細胞

− 抗體稀釋緩沖液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含有 0.1% Tween-20 的 PBS，例如  T434505、P196391）

− 洗滌緩沖液 PBS（例如 P492453）或 PBS-T（含 0.1% Tween-20 的 PBS，例如  T434505、P196391）

− 偶聯一抗

− 疏水性屏障筆——可選用于載玻片或蓋玻片上的小細胞體積

步驟

所需時間約12小時15分鐘。

1. 確定要使用的最佳抗體稀釋度。然后在抗體稀釋緩沖液中稀釋抗體。

提示：抗體數據表上通常會建議最佳稀釋度。如果沒有，您可能需要進行稀釋以找到最有效的抗體濃度。抗體稀釋緩沖液可以僅為PBS。我們還建議添加 0.1% Tween（以降低表面張力）和 1% BSA（作為額外的封閉劑以減少非特異性結合）。

2. 將樣品浸入預稀釋的一抗中。

室溫孵育2小時，或4°C過夜。

警告：孵化時間可能需要優化。

提示 1：抗體溶液需要完全覆蓋您的樣品。

提示2： 使用疏水性屏障筆可以幫助容納小體積。

3. 用 PBS 或 PBS-T 清洗樣品3次。

4. 按照制造商推薦的方案完成任何適當的復染。

第 5 階段  復染和檢測

ICC 過程的最后一步是樣品封片并檢測信號。這涉及將蓋玻片添加到載玻片上（用于蓋玻片上的細胞培養物），或將蓋玻片覆蓋到樣本上，以實現成像。

典型的細胞核復染劑是 DAPI （D598342）、HOECHST 33342 （H288601） 或 DRAQ7 （D266297）。還有一些細胞器或細胞骨架復染劑可用（P287444） 。

所需材料

− 用熒光團偶聯抗體染色的細胞

− 熒光復染劑（可選，例如：DAPI D598342）

− 適用于熒光檢測的封固劑（適用于蓋玻片或載玻片上的細胞）

− 密封劑（用于蓋玻片或載玻片上的細胞，例如：指甲油）

− PBS（適用于孔中的細胞，例如 P492453）

− 熒光顯微鏡

步驟

1. 如果需要，將樣品浸入復染溶液中。

1.1. 根據制造商的指導在室溫下孵育，或直至觀察到所需的顏色。

提示：某些封固劑含有熒光復染劑（參見 H288601）。這樣就無需單獨對載玻片進行復染以添加封固劑。

2. 封固您的樣品。

提示：封片劑通常含有抗淬滅劑，有助于更長時間地保存熒光。

3. 使用適當的激發/發射濾光片組和/或激光器對樣品進行成像。

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