刷屏世界各大媒體！今天，中國科學(xué)院上海神經(jīng)科學(xué)研究所傳出“石破天驚”的聲音：第一個經(jīng)由體細(xì)胞核移植產(chǎn)生的靈長類動物被成功克隆。兩只名為“中中”和“華華”的長尾獼猴，分別在八周和六周前誕生于中華大地。北京時間1月24日上午，中國科學(xué)院和Cell雜志在北京舉辦中外新聞發(fā)布會，神經(jīng)科學(xué)研究所所長蒲慕明先生介紹了這項里程碑式的研究成果，迅速引起中外媒體廣泛關(guān)注和追逐。今天，論文在線發(fā)表在Cell雜志上。

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體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建的克隆獼猴“中中”和“華華”

論文上線后，旋即引起中外媒體熱烈追逐，從大眾傳媒如美國的路透社、美聯(lián)社、華盛頓郵報、CNN，CBS，NPR，國家地理雜志，英國的BBC、每日電訊、 每日郵報、中國新華社，到科學(xué)媒體如Nature, Science, New Scientists等，都第一時間對中中和華華做了刷屏的大篇幅深度報道。此前，從來沒有一項中國科研成果，能夠如此地刷屏外媒。為什么克隆獼猴能引起如此大的轟動呢？

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背 景

非人靈長類動物，指除人以外的所有靈長類動物，在基礎(chǔ)研究和生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域有重要的地位。相比于大小鼠等嚙齒類哺乳動物，非人靈長類與人類有著更多相似的生物學(xué)特征，被認(rèn)為是研究高等認(rèn)知以及腦疾病的最理想的模式動物。因此，國際科學(xué)界很早就對非人靈長類高度重視，并建立了很多非人靈長類研究中心。中國非人靈長類資源非常豐富，全國各地有多個非人靈長類動物飼養(yǎng)繁殖基地。國家對利用非人靈長類開展科學(xué)研究也非常重視，于2017年底出臺的“中國腦計劃”項目中，非人靈長類動物研究就占據(jù)非常重要的地位。

論文通訊作者、中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所非人靈長類研究平臺主任孫強(qiáng)介紹說：“我們克隆出的猴子模型可被用來研究很多靈長類生物學(xué)問題。此項技術(shù)能幫助科學(xué)家制備具有相同遺傳背景的猴子，并對克隆猴的基因按需進(jìn)行編輯，為研究人類腦部疾病、癌癥、免疫系統(tǒng)或代謝紊亂等提供了真實可靠的模型，還可用于測試相關(guān)的治療藥物。

“中中”和“華華”并不是世界上第一個被克隆出的靈長類動物。在1999年，科學(xué)家即使用胚胎分裂技術(shù)克隆出了一只叫Tetra的猴子。不過， 該克隆技術(shù)比較簡單，是基于雙胞胎自然形成的模式，且一次最多只能產(chǎn)生四個后代。而在這項最新的研究中， “中中”和“華華”是通過體細(xì)胞核移植技術(shù)（somatic cell nuclear transfer，SCNT）構(gòu)建獲得。20多年前，那只叫做Dolly的小羊就是用同樣的技術(shù)被克隆出的。多利羊是第一個以成體動物細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制而產(chǎn)生的克隆動物，意味著無需精子這類生殖細(xì)胞，運用已經(jīng)分化的體細(xì)胞也能夠產(chǎn)生和原細(xì)胞基因完全相同的子代。

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什么是體細(xì)胞核移植技術(shù)呢？

首先，研究人員將卵細(xì)胞的細(xì)胞核去除，再將另一個成熟分化的體細(xì)胞的細(xì)胞核取出，通過顯微注射打進(jìn)卵細(xì)胞內(nèi)。重構(gòu)后的卵細(xì)胞繼續(xù)分化發(fā)育，最終形成與細(xì)胞核供體具有相同遺傳特征的動物克?。▓D2）。

體細(xì)胞核移植技術(shù)成功克隆“多莉”羊

SCNT技術(shù)的生物學(xué)本質(zhì)即細(xì)胞重編程（cell reprogramming）。終末分化的成熟體細(xì)胞，與具有多分化潛能的干細(xì)胞相比，其染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、基因的活性等都有很大不同。在干細(xì)胞中，多能相關(guān)基因處的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較松散，有助于這些基因的轉(zhuǎn)錄激活。當(dāng)細(xì)胞的分化方向確定，多能相關(guān)基因失活，那些維持特定細(xì)胞類型的基因轉(zhuǎn)而開啟表達(dá)。

近年來，表觀遺傳學(xué)的研究突破幫助人們更深刻地理解了重編程的機(jī)制。知社在上周剛剛報道了清華大學(xué)丁勝教授課題組的最新研究成果（單擊查看）。他們用表觀基因組的定向編輯技術(shù)，研發(fā)出了一種簡便快捷地制備誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）的方法。

值得一提的是，無論是傳統(tǒng)的SCNT，還是iPSC研究，都是實現(xiàn)細(xì)胞重編程、獲得多分化潛能干細(xì)胞的一種手段（圖3）?；诩?xì)胞重編程的iPSC研究，正是始于SCNT的啟發(fā)，又有超越SCNT技術(shù)的優(yōu)點。而SCNT技術(shù)的優(yōu)點，也是目前的iPSC技術(shù)無法超越的。今天，SCNT技術(shù)因為“中華”猴的問世，再次成為人們關(guān)注的焦點。

兩種獲得具有多向分化潛能的干細(xì)胞的技術(shù)：(a) 體細(xì)胞核移植技術(shù)；(b) 誘導(dǎo)性重編程

在“多莉羊”之后的20多年間，同樣運用SCNT制備的其他克隆動物，如牛、鼠、豬、貓、兔、馬、狗、狼等，也相繼誕生。那么，

為何克隆猴卻遲遲不肯問世？

首先，猴子卵細(xì)胞的獲取存在困難。就生殖生理特性來說，食蟹猴和恒河猴都是單胎動物，在大小鼠、牛和豬等動物中收集獲得卵母細(xì)胞資源的方法并不可行。由于存在優(yōu)勢卵泡效應(yīng)，即使是用激素對其進(jìn)行超數(shù)排卵處理，所獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量仍非常有限。這種數(shù)量上的限制極大影響了非人靈長類動物克隆的成功。

不僅如此，由于SCNT本身存在的缺陷，導(dǎo)致通過克隆獲得的重構(gòu)胚胎發(fā)育效率很低。幾年前，美國科學(xué)家用SCNT分別制造出了猴胚胎干細(xì)胞和人類胚胎干細(xì)胞，但是它們的發(fā)育能力十分有限。這主要是因為與其他哺乳動物的克隆相比，靈長類體細(xì)胞核對SCNT有抗性。

這種抗性在近年的表觀遺傳學(xué)研究中被鑒別出來，被稱為重編程抗性區(qū)（Reprogramming Resistence Regions, RRRs）。在哈佛大學(xué)張毅教授的兩項研究（圖4）中，明確了小鼠和人的供體細(xì)胞核的基因組中均存在RRRs。在這些區(qū)域，富集著一類組蛋白甲基化修飾，阻礙了具有多分化潛能調(diào)控功能的基因表達(dá)，使得SCNT技術(shù)中的重構(gòu)胚胎發(fā)育受阻。

明確了阻礙，自然就要尋求辦法克服。

張毅教授研究組發(fā)現(xiàn)，如果向移植了體細(xì)胞核的卵細(xì)胞中引入KDM4D——一類組蛋白去甲基酶，去除這類組蛋白甲基化修飾，就能夠提高重構(gòu)卵細(xì)胞的重編程效率和正常發(fā)育分化能力，進(jìn)而提高核移植的成功率。

在用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備病人特異性的人胚胎干細(xì)胞的過程中， 引入組蛋白去甲基化酶，能夠提高重構(gòu)細(xì)胞的分化效率。

此外，在之前的研究中，組蛋白去乙?；敢种苿ㄈ鏣SA和scriptaid）已被用于提高哺乳動物（小鼠，牛，豬，猴和人）的SCNT的成功率。組蛋白乙酰化修飾有助于打開染色質(zhì)，啟動多能性相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)重編程。

克隆猴成功的秘訣有哪些呢？

中科院神經(jīng)科學(xué)研究所的研究人員克服了克隆靈長類動物的挑戰(zhàn)。他們成功的關(guān)鍵即在于充分利用了最新的表觀遺傳學(xué)成果：

完成核移植之后，研究人員向卵細(xì)胞導(dǎo)入了表觀遺傳修飾的調(diào)節(jié)因子：KDM4D和TSA，以此來啟動胚胎發(fā)育的功能基因。因為導(dǎo)入了表觀遺傳修飾因子，體細(xì)胞核中原本被抑制的基因重新被激活，并最終在代孕雌猴中獲得了很高比例的受孕率和正常發(fā)育率。

具體來說，在用TSA處理后又注入KDM4D mRNA的重構(gòu)卵中，有44.7%發(fā)育成了囊胚。這些囊胚中又有64.7%形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner Cell Mass）。相比只使用TSA——囊胚獲得率為16.7%——有很大提高。由此看來，組蛋白去甲基化酶KDM4D顯著改善了SCNT的猴胚胎的表觀遺傳重編程，這一點與張毅教授組有關(guān)鼠和人的發(fā)現(xiàn)是相同的。

那么，組蛋白甲基化修飾究竟作用于供體核的哪些基因？換句話說，哪些基因的失活在阻礙重編程的進(jìn)程呢？為了找到答案，研究人員用RNA測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了可能導(dǎo)致SCNT克隆胚胎發(fā)育不良的基因，包括一些發(fā)育多能性相關(guān)基因如Dppa2，Dppa4和Myc，以及其他抑制基因如Zscan4和Polr3h。這些基因在胚胎發(fā)育中發(fā)揮了什么功能？如何通過操縱這些基因來促進(jìn)SCNT胚胎的發(fā)育？這些謎底的揭開需要進(jìn)一步的研究。

“中中”和“華華”的供體細(xì)胞核，來自同一只流產(chǎn)的猴胚胎的成纖維細(xì)胞，研究人員從中獲得了大量遺傳背景相同的細(xì)胞核。他們也嘗試了使用成年猴的體細(xì)胞核作為供體，但所得的克隆猴因呼吸異常，在出生后只存活了幾個小時。 由此看來，相比胚胎體細(xì)胞，成體體細(xì)胞的重編程的阻礙更大，但其具體機(jī)制還不明確。蒲慕明院士在發(fā)布會中提到，如果成體體細(xì)胞作為供體的重構(gòu)胚胎再多一些，也許是會成功的。

中科院神經(jīng)科學(xué)研究所的研究人員指出，他們選用胚胎成纖維細(xì)胞作為供體的另一個原因，是便于在體外對其進(jìn)行基因編輯和篩選，避開CRISPR-Cas9技術(shù)的脫靶問題和嵌合體現(xiàn)象，進(jìn)而大量獲得遺傳背景相同的克隆動物。

研究負(fù)責(zé)人孫強(qiáng)介紹說，“我們嘗試了多種方法，但只有一種可行。成功得到克隆猴之前，我們經(jīng)歷了多次失敗?！?論文第一作者劉真曾花了三年時間練習(xí)和優(yōu)化SCNT技術(shù)（圖5）。為了快速準(zhǔn)確地從卵細(xì)胞中去除細(xì)胞核，促進(jìn)供體細(xì)胞核和去核卵細(xì)胞的融合，他測試了多種方法。

體細(xì)胞核移植技術(shù)中的顯微注射步驟（B,C,D,E,F）； 重構(gòu)細(xì)胞融合后正常發(fā)育為帶有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的囊胚（J）。

這些優(yōu)化改進(jìn)操作包括：用偏振光成像系統(tǒng)定位并去除卵細(xì)胞的遺傳物質(zhì)；將核供體細(xì)胞與仙臺病毒包膜（HVJ-E）一起溫育；使卵細(xì)胞透明帶形成激光損傷，以便于將供體細(xì)胞核注入卵周間隙（圖5D、E、F）。

中科院神經(jīng)科學(xué)研究所所長、該研究的合作者蒲慕明院士指出，SCNT技術(shù)的實驗步驟非常精致，你操作得越快，卵細(xì)胞受到的破壞就越少。劉真博士的手很巧，很能干，但也付出了大量的實踐。并不是每個人都能準(zhǔn)確迅速地完成去核和細(xì)胞融合的操作，核移植技術(shù)的優(yōu)化是我們?nèi)〉眠@一成功的關(guān)鍵.

中國科學(xué)家使用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備出克隆猴

目前，“中中”和“華華”還在喝奶（瓶喂）期，它們的生長發(fā)育與同齡猴子相比無異。研究人員也會繼續(xù)關(guān)注“中中”和“華華”的身體發(fā)育和智力發(fā)展。預(yù)計未來幾個月會有更多的克隆獼猴誕生。研究人員也計劃繼續(xù)改進(jìn)技術(shù)。

在慶?？寺『锍晒χ?，有待科學(xué)家解決的問題還有很多。比如，如何安全地獲取胎猴的體細(xì)胞？為何成體細(xì)胞核產(chǎn)生的克隆猴存活時間短？不同哺乳動物重構(gòu)胚胎的重編程能力差異是由哪些因素決定的？不同哺乳動物的多能相關(guān)基因的表觀修飾有何差異？等等。

除此之外，人們最關(guān)心的，可能還是：

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克隆猴技術(shù)所面對的倫理問題

這項動物研究工作嚴(yán)格遵循了美國國立衛(wèi)生研究院制定的國際指南。至于在克隆非人類靈長類動物時，哪些做法可取，哪些做法不可取，孫強(qiáng)和蒲慕明鼓勵科學(xué)界就此展開討論。

蒲慕明院士強(qiáng)調(diào)，我們非常清楚這類準(zhǔn)則的重要性，將來，無論在世界何處，如果使用非人靈長類動物進(jìn)行實驗，都需要科學(xué)家嚴(yán)格遵循道德倫理標(biāo)準(zhǔn)。

在新聞發(fā)布會上，也有多位記者就使用靈長類動物做實驗的倫理問題發(fā)問。對此，蒲慕明院士表示：

“克隆猴的目的是出于其對人類醫(yī)學(xué)價值的考量?，F(xiàn)有的很多動物疾病模型與真實人類疾病表現(xiàn)有不同之處，猴子作為動物模型有其他動物無法比擬的優(yōu)勢。而且，這項克隆猴技術(shù)使得短期內(nèi)（約9個月）就能獲得遺傳背景完全相同的一代動物，實際上最終能夠減少動物的使用量。

幾年前基因編輯興起的時候，人們就其應(yīng)用做過熱烈討論，出臺了嚴(yán)格的管理規(guī)則，現(xiàn)在實施得比較好，收到了不錯的效果。中國的動物實驗也會嚴(yán)格遵守國際標(biāo)準(zhǔn)。希望這項工作能使更多的人認(rèn)識到克隆猴作為動物模型的優(yōu)越性和重要性?！?/span>

不過，相信人們還是會禁不住發(fā)問：

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“克隆猴會被人類溫柔以待嗎？”

“克隆猴已經(jīng)降臨，克隆人還會遠(yuǎn)嗎？”
……

對于這樣一個科技改變世界的時代，你是充滿期待還是……不寒而栗？

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參考資料

1 劉真, 蔡毅君, 孫強(qiáng). 非人靈長類基因修飾模型研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(10): 1665-1673.

2 Matoba S et al.Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation.Cell. 2014, 6;159(4):884-95.

3 Chung YG et al.Histone Demethylase Expression Enhances Human Somatic Cell Nuclear Transfer Efficiency and Promotes Derivation of Pluripotent Stem Cells.Cell Stem Cell. 2015, 3;17(6):758-766.

4 Mummery CL, Roelen BA.Stem cells: Cloning human embryos.Nature. 2013,13;498(7453):174-5.

5 Loi P et al., A New, Dynamic Era for Somatic Cell Nuclear Transfer?Trends Biotechnol. 2016, 34(10):791-7.

6 Cell, Liu, Z. et al: "Cloning of macaque monkeys by somatic cell nuclear transfer"